祛瘀化痰方聯合促排卵方案對多囊卵巢綜合征患者胰島素信號通路相關蛋白的影響

張淑梅 韓玉芳

(青海大學附屬醫院產科,西寧，814000)

多囊卵巢綜合征(Polycystic Ovary Syndrome，PCOS)導致的代謝綜合征以及心血管疾病日益受到臨床關注，高脂血癥、胰島素抵抗等高危因素的存在，導致PCOS的發病率不斷上升[1]。采用藥物改善內分泌與代謝紊亂成為關鍵，臨床治療PCOS大多采用降低雄激素、促排卵以及降低胰島素等治療[2]。其中促排卵方案，有氯米芬(Clomiphene Citrate，CC)、人絕經期促性腺激素(Human Menopausal Gonadotropin，hMG)等。但由于藥物治療會產生一系列腸胃不良、卵巢過度刺激等不良反應，使得臨床治療受到一定的限制[3]。中醫認為痰濕內盛是PCOS的主要病因，腎虛為本，痰濕痰血為標，以祛痰濕、化瘀血為主要原則，祛瘀化痰方劑可以有效改善PCOS患者糖、脂代謝紊亂及胰島素敏感性。本研究對祛瘀化痰方聯合促排卵方案對PCOS患者胰島素信號通路相關蛋白的影響進行分析，進一步探討中西醫聯合治療PCOS的機制。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年4月至2018年4月我院收治PCOS患者100例，按照隨機數字表法分對照組和觀察組，每組50例。觀察組年齡22～45歲，平均年齡(36.62±8.47)歲；病程2～8年，平均病程(4.62±2.42)年；體重指數16.4～23.6 kg/m2，平均體重指數(21.02±0.61)kg/m2。對照組年齡20～40歲，平均年齡(35.43±9.07)歲；病程1～8年，平均病程(4.36±2.12)年；體重指數16.2～23.8 kg/m2，平均體重指數(21.06±0.64)kg/m2。2組一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫學倫理委員會批準，患者及其家屬均同意參加本研究，并自愿簽署知情書。

1.2 診斷標準

1.1.1 西醫診斷標準 1)無排卵或排卵稀少；2)生化和(或)臨床表現為高雄激素血癥；3)超聲檢查顯示卵巢體積>10 mL，存在>12個直徑為2～9 mm的卵泡[4]。符合上述2條標準，并排除先天性腎上腺皮質增生、庫欣綜合征等高雄激素疾病即可診斷為PCOS。

1.1.2 中醫診斷標準 1)主癥：閉經；月經不調；婚久不孕；痤瘡；2)次癥：煩躁易怒；乳房脹痛；胸肋脹滿；精神抑郁；喜嘆息；噯氣；少腹脹痛；3)舌脈：脈弦或澀；舌紅苔薄白。具備上述全部主癥或1項主癥和全部次癥，參考舌脈即可診斷[5]。

1.3 納入標準 患者年齡20～45歲；患者意識清楚，無智力與表達障礙；所有PCOS患者均經臨床病理確診；輸卵管造影以及腹腔鏡檢查確保輸卵管通暢。

1.4 排除標準 年齡在20歲以下或40歲以上者；合并盆腔粘連、子宮肌瘤以及近期使用促排卵藥物患者；有自身免疫性疾病患者；有嚴重的肝腎功能不全及消化道疾病者；對中藥或者其他研究藥物禁忌或者過敏者。

1.5 治療方法 對照組于患者月經周期或者黃體酮撤退性出血第5天開始，口服CC(通化仁民藥業股份有限公司，國藥準字H22022100),規格：50 mg,50 mg/d。用藥5 d后，第10天開始肌內注射hMG(煙臺北方制藥有限公司，國藥準字H20033108)，75 IU/d，每周遞增量37.5 IU/d。根據患者卵泡的發育情況來決定hMG用藥的時間與劑量。觀察組在對照組的基礎上聯用祛瘀化痰方劑進行治療，患者于月經周期第5天或者黃體酮撤退性出血第5天開始。方劑如下:淫羊藿、菟絲子、枸杞、蒼術、陳皮、赤芍、丹參各20 g，巴戟天、山茱萸、茯苓、當歸各15 g，法半夏10 g，隨證加減。上述藥物聚齊浸泡30 min，用500 mL水煎取，取湯汁200 mL，2次/d，早晚分服，1劑/d，經期停用。服藥期間禁止服用研究外的其他藥物，禁酒禁煙，嚴禁生冷、辛辣等刺激性食物，2組患者用藥為6個月經周期。

1.6 觀察指標 1)中醫證候積分：根據《中藥新藥臨床研究指導原則》臟腑諸證考察與分析制定的評價標準[6]，根據患者主癥及次癥的癥狀評分，將閉經、月經不調、婚久不孕、痤瘡等主癥，按其嚴重程度分為無、輕、中、重4個等級，相應得分為0分、2分、4分、6分。將煩躁易怒、乳房脹痛、胸肋脹滿、精神抑郁、喜嘆息、噯氣、少腹脹痛等次癥按嚴重程度分為無、輕、中、重4個等級，相應得分為0分、1分、2分、3分，舌脈不計分。中醫證候總積分越高，提示患者臨床癥狀越嚴重。2)觀察血清胰島素信號通路相關蛋白表達：治療前、治療6個月經周期后空腹抽取患者的靜脈血8 mL于真空采血管中。采用蛋白印跡法檢測2組患者胰島素信號通路相關蛋白的表達。步驟如下：3 000 r/min，離心20 min后分離血清，收集樣本細胞，加入適當裂解液后消化洗滌，低溫離心。純乙醇洗滌沉淀后用移液器吸取離心管中液體，室溫下干燥沉淀。每1×106個細胞中加入150 μL蛋白溶解緩沖液，95 ℃金屬浴8 min，室溫下靜置溶解沉淀60 min，離心去除不溶物。采用考馬斯亮藍法對蛋白質的含量進行測定。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)膠制備完成后進行蛋白質變性及電泳。即：取出提取的樣品總蛋白，插入冰中使其融化，盡量減少蛋白質的降解。蛋白質凝膠電泳上樣緩沖液與相應體積的樣品總蛋白輕輕混勻，95 ℃變性10 min，立即插入冰中備用。凝膠孔中輕輕加入樣品，使得樣品通過分離膠與濃縮膠，當染料到達分離膠適當位置時，結束電泳。蛋白凝膠轉膜及檢測：凝膠電泳結束后，采用轉移電泳方式將凝膠上分離到的蛋白條帶轉印至固相支持物上，采用半干轉的轉膜方式以及聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)作為固相支持物，應用一抗和二抗對其孵育及檢測。

1.7 療效判定標準 根據2組患者月經、性激素以及卵巢恢復情況評估2組臨床療效：痊愈：月經周期、質、色、量恢復正常，卵巢多個不成熟卵泡情況消失，卵巢大小和性激素水平恢復正常；顯效：與治療前比較，月經周期、質、色、量有明顯改善，卵巢中不成熟卵泡數量明顯減小，卵巢體積明顯縮小，性激素水平趨于正常；有效：月經周期、質、色、量較治療前有所改善，臨床癥狀有所改善；無效：與治療前比較，患者病情無明顯變化。有效率=(痊愈例數+顯效例數+有效例數)/總例數×100%。

2 結果

2.1 2組臨床療效比較 治療后，觀察組治療有效率較對照組高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 2組中醫證候積分比較 治療前，2組中醫證候積分差異無統計學意義(P>0.05)；與治療前比較，治療后2組中醫證候積分明顯降低，對照組高于觀察組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 2組臨床療效比較

表2 2組中醫證候積分比較分)

2.3 2組胰島素信號通路相關蛋白表達比較 與治療前比較，2組治療后AKT蛋白表達均明顯升高，且觀察組上述指標改善情況較對照組佳，差異有統計學意義(P<0.05)；2組治療后的P-INSR、INSR、P-IRS、IRS、P-PI3K、PI3K、P-AKT、P-ERK1、ERK1、P-ERK2、ERK2蛋白表達比治療前均有明顯下降，且觀察組上述指標改善情況較對照組佳，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

3 討論

西醫認為，PCOS的發病機制為下丘腦-垂體-卵巢軸調節功能失常，目前臨床并無好的治療方式[7]。中醫文獻記載中并無PCOS的病名，按照患者臨床表現以及病情演化規律，可將其歸屬于“經量過少”“閉經”“月經后期”“不孕癥”等范疇。此證多由肝氣郁滯、臟腑功能失常、沖任二脈受損、氣血失調、血海蓄溢失常等因素引起[8]。PCOS證候虛實夾雜，血痰、痰濕都為臟腑陰陽失衡的產物。經血是基本物質，氣血生化之源為臟腑，肝為藏血之臟，調節月經，主疏泄，喜條達而惡抑郁。血脈不通、氣血不和，卵子順利排出受阻，經水不調，不能成孕[9-10]。PCOS治療的主要目的為調節內分泌。

表3 2組胰島素信號通路相關蛋白表達比較

注:與本組治療前比較，*P<0.05

祛瘀化痰方劑主要由淫羊藿、菟絲子、枸杞、蒼術、陳皮、赤芍、丹參、巴戟天、山茱萸、茯苓、當歸、法半夏等中藥組成[11]。方中淫羊藿補腎壯陽，增加心腦血管血流量，促進造血功能、免疫功能及骨代謝，具有抗衰老、抗腫瘤等功效。丹參活血化瘀，對于經閉經痛具有良好功效。菟絲子、枸杞、巴戟天、山茱萸補易陰陽，當歸、赤芍補血活血。法半夏降逆止嘔，燥濕化痰。茯苓利水消腫、滲濕、健脾、寧心[12-13]。蒼術、陳皮燥濕健脾，理氣化痰。中藥合用，補腎、祛痰、化痰[14]。本研究結果顯示，治療后對照組治療有效率低于觀察組，觀察組的中醫證候積分低于對照組。與常規西藥治療比較，對PCOS患者行祛瘀化痰方劑聯合西藥治療能夠有效減輕患者臨床癥狀，提高臨床療效。

機體內的胰島素通過與細胞表面的受體結合作用于細胞，胰島素與配體結合后，INSR特定的酪氨酸殘基自體磷酸化，開始信號轉導[15]。IRS分子在胰島素信號通路中屬于介導者，而PI3K是一類特異催化磷脂酰肌醇的激酶[16-17]。AKT是-PI3K下游的直接靶蛋白，磷酸化后，進一步激活或抑制其下游靶蛋白[18]。ERK屬于MAPK的一員，被激活的ERK可以調控下游相關基因的轉錄表達，參與促細胞分裂信號的轉導通路，進一步引起細胞增殖，傳遞以及調控胰島素信號[19-20]。本研究顯示，2組治療后的AKT蛋白表達比治療前均有明顯升高，P-INSR、INSR、P-IRS、IRS、P-PI3K、PI3K、P-AKT、P-ERK1、ERK1、P-ERK2、ERK2蛋白表達比治療前均有明顯下降，且觀察組改善比對照組佳。說明采用祛瘀化痰方劑治療PCOS患者能夠有效調控胰島素信號通路相關蛋白表達。由此可見，祛瘀化痰方劑聯合西藥是治療PCOS患者的良方。本研究因研究時間和經費的限制，仍存在一定的不足之處，如納入樣本量較小，未對患者長期隨訪觀察，未分析2組用藥安全性，未對患者磷酸化以及信號轉導通路機制等進行研究，故后期仍需加大樣本量進行多中心的深入研究。

綜上所述，對PCOS患者實施祛瘀化痰方劑聯合西藥治療效果好，能有效減輕患者臨床癥狀，調控機體胰島素信號通路相關蛋白的表達，這為臨床治療PCOS提供了一定的參考價值。