胚胎單基因病診斷患者輔助生殖累積妊娠率低的原因初探

王珺，陳書強，張亨德，黃劍磊，李博

(空軍軍醫大學唐都醫院婦產科生殖醫學中心，西安 710038)

單基因遺傳病是一類由1個或1對等位基因的突變引起的疾病，符合孟德爾遺傳規律。雖然每種單基因遺傳病的發病率較低，但是因為其種類繁多，總體患病率并不低。目前已發現的單基因遺傳病有7 000多種，涉及基因3 000多個。目前大多數單基因遺傳病還缺乏有效的治療方法，致死率、致殘率均很高[1-2]。胚胎植入前單基因病檢測(preimplantation genetic test for monogenetic，PGT-M)是一種與輔助生殖(ART)相結合的遺傳學診斷技術[3]，即在胚胎植入前進行特定的遺傳診斷，從而避免單基因病患兒出生。這為單基因病受累家庭帶來了新的希望，但通過臨床觀察發現PGT-M技術的累積妊娠率并不高，本文將針對這一現象做初步探討，為PGT-M臨床遺傳咨詢提供參考。

材料與方法

一、研究對象

收集我中心2016年7月至2017年6月期間接診的PGT-M患者，共31個促排卵周期、102枚胚胎。患者平均年齡(32.4±4.1)歲。其中常染色體隱性遺傳(AR)8個周期，常染色體顯性遺傳(AD)7個周期，X連鎖隱性遺傳(XR)15個周期，X連鎖顯性遺傳(XD)1個周期。

同時收集我中心2016年7月至2017年6月期間進行胚胎植入前染色體非整倍性檢測(preimplantation genetic test for aneuploidies，PGT-A)患者[3]，90個周期，350枚胚胎。患者平均年齡(31.9±4.2)歲。

患者納入標準：PGT-A：(1)復發性流產(≥3次)；(2)反復胚胎種植失敗(≥3次)；(3)不良孕產史；(4)嚴重男性不育。PGT-M：有明確單基因病致病風險。患者排除標準：(1)不符合上述入選標準者；(2)中途放棄檢測，導致無實驗結果者。

二、研究方法

1.胚胎活檢：PGT患者，體外受精后116～144 h，待胚胎發育到囊胚期(D5-D6)，并達到活檢標準時(4B-C+以上胚胎)，在內細胞團對側使用激光在透明帶上打一直徑6～10 μm的孔，繼續培養4～6 h，待滋養外胚層細胞形成疝，激光法活檢5～10個細胞，PBS洗滌后，裝入預先準備好的0.2 ml EP管內。

2.胚胎擴增：使用Qiagen REPLI-g single cell kit(212768，RUBICON GENOMICS，美國)提取試劑盒，對胚胎活檢細胞進行裂解、DNA提取、全基因組預擴增及擴增。然后用QubitdsDNA HS Assay Kit(ZYKW-KY-002-2，嘉寶仁和)對全基因組DNA產物進行定量檢測。

3.胚胎植入前遺傳學檢測：本研究所有PGT檢測，均是以高通量測序技術(Next Generation Sequencing，NGS)為基礎，采用Ion PROTON進行檢測。對于PGT-A患者，采用胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒(ZYKW-X-013，嘉寶仁和)行染色體非整倍性檢測。對PGT-M患者，采用S-PGDM法：胚胎植入前染色體非整倍體檢測試劑盒/胚胎植入前單基因病檢測試劑盒(ZYKW-X-013/ZYKW-X-016，嘉寶仁和)進行染色體非整倍性及單基因異常檢測。

三、統計學處理

結 果

一、兩組基本情況比較

PGT-M患者與PGT-A患者相比，在女方平均年齡、平均Gn使用量、平均Gn使用天數、平均獲卵數等方面差異均無統計學意義(P>0.05)，PGT-M患者染色體非整倍性胚胎占比與PGT-A患者相比無顯著性差異(P>0.05)，患者平均內膜厚度無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 PGT-M患者與PGT-A患者的基本情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者的促排卵結果

PGT-M患者31個促排卵周期，共計獲得卵母細胞434枚，成熟卵母細胞351枚(80.88%)，形成胚胎271枚(62.44%)，最終獲得可行遺傳學診斷的囊胚102枚(23.50%)。PGT-A患者，90個促排卵周期，共計獲得卵母細胞1 393枚，成熟卵母細胞1 132枚(81.26%)，形成胚胎871枚(62.53%)，最終獲得可行遺傳學診斷的囊胚350枚(25.13%)。

三、胚胎染色體非整倍性檢測結果

本研究用于PGT-M檢測的102枚胚胎，其中94枚進行了染色體非整倍性及結構異常NGS檢測，8枚胚胎由于單基因病結果異常，未繼續進行染色體檢測。在94枚胚胎中，染色體整倍性胚胎43枚(45.74%)，染色體非整倍性胚胎51枚(54.26%)。PGT-A檢測的胚胎350枚，染色體整倍性胚胎169枚(48.29%)，染色體非整倍性胚胎181枚(51.71%)。

四、胚胎單基因病致病位點檢測結果

本研究用于PGT-M檢測的102枚胚胎，96枚胚胎進行了單基因病致病位點的檢測，6枚由于已檢測為染色體異常的胚胎而未繼續單基因致病位點檢測。在96枚胚胎中，完全正常胚胎28枚，攜帶胚胎29枚，致病胚胎37枚，無法判斷胚胎2枚。完全正常胚胎占29.17%，表型正常胚胎占59.38%。根據孟德爾遺傳規律，本研究所涉及的不同類型單基因病周期，96枚胚胎中，理論完全正常胚胎40.5枚，占42.19%，理論表型正常胚胎66.75枚，占69.53%。

統計分析結果顯示，完全正常胚胎，實際占比顯著小于理論占比(P<0.05)；表型正常胚胎，實際占比較理論占比低，但無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 PGT-M患者胚胎單基因病診斷結果及孟德爾理論預測結果[n(%)]

注：與理論完全正常相比，*P<0.05

五、PGT-M患者檢測后的有效胚胎占比情況

31個促排周期所獲得的102枚胚胎中，染色體整倍性胚胎43枚，其中有效胚胎(即表型正常胚胎，包含正常胚胎及攜帶胚胎)28枚，占27.45%，其中完全正常胚胎(不含攜帶胚胎)13枚，占12.75%。

討 論

染色體非整倍性與女性年齡、復發性流產、染色體結構異常等密切相關[4-7]。隨著女性年齡的增長，染色體非整倍性比率增加，流產率增加[5-6，8]。遺傳因素在復發性流產的誘因中占70%，染色體非整倍性異常是遺傳因素中的最主要原因[7，9]。

PGT-A主要適用于存在高度胚胎非整倍性風險的夫婦，以提高胚胎著床率及活產率，降低流產率[10]；PGT-M主要針對存在單基因病致病風險的夫婦，以減少出生缺陷，實現優生。我們的檢測結果顯示，PGT-A患者囊胚染色體非整倍性占比51.71%。這與文獻報道基本一致[11-12]。PGT-M患者，均是以排除單基因病致病位點為目的，并不屬于不孕不育人群。有最新的研究報道顯示，在非不孕不育人群中，胚胎染色體非整倍性顯著低于不孕不育人群[13]。

本研究的數據顯示：PGT-M患者在平均年齡與PGT-A患者無顯著差異的條件下，PGT-M患者的整倍性胚胎(45.74%)，與PGT-A(48.29%)相比并無顯著性差異，也就是說，PGT-M患者所獲得的染色體整倍性胚胎與染色體非整倍性高發的不孕不育人群(PGT-A)水平相當，從占比上看，甚至整倍性胚胎占比更少。僅通過染色體檢測這一項，就已經淘汰掉了54.26%的胚胎，導致后續可用胚胎數驟減。分析原因，可能與Gn用量有一定關系。研究指出胚胎非整倍體形成與排卵藥物劑量相關[14-15]。發生機制可能是，在促排卵過程中，生理條件下的激素節律和穩態發生急劇變化，增加卵母細胞形成過程中染色體的分離錯誤，最終導致受精胚胎發生染色體異常，造成流產率增高[16]。本研究顯示，雖然Gn用量在PGT-M與PGT-A之間無顯著差異，但PGT-M患者促排卵狀態已屬于非自然狀態，很可能胚胎染色體非整倍性會隨之增加，因此，這可能是PGT-M患者累積妊娠率低的可能原因之一。

在單基因病致病位點檢測中，實際檢測完全正常胚胎占比(29.17%)顯著低于孟德爾遺傳規律預測的完全無致病突變胚胎占比(42.19%)，而實際表型正常胚胎占比(59.38%)與預測值(69.53%)相比雖然無統計學差異，但也較預測值低大約10個百分點，這一結果并未見相關文獻報道。這意味著單基因病致病位點檢測可能會淘汰掉40%～70%的胚胎，筆者猜測這是PGT-M患者累積妊娠率低的可能原因之二。

目前，臨床醫生在PGT-M患者輔助生殖助孕之前行遺傳咨詢時，往往是以孟德爾遺傳規律為參考，估算最終可用胚胎數，對患者的臨床結局預期過高。而患者在最終選擇胚胎植入時，由于家庭壓力或心理焦慮等原因，往往又傾向于選擇完全正常的胚胎而不是表型正常的攜帶胚胎，這無疑更是雪上加霜，導致可用胚胎數再次減少。

PGT-M患者胚胎遺傳學診斷后，臨床可以使用的有效胚胎，需滿足染色體非整倍性正常且至少單基因病診斷表型正常。綜合本研究中31個周期的PGT-M胚胎檢測結果，能夠供患者選擇的染色體正常且表型正常的有效胚胎28枚，只占遺傳學檢測囊胚的27.45%，而染色體及單基因病致病位點完全正常的胚胎13枚，僅占12.75%。目前還不能準確統計出PGT-M患者31個促排卵周期的累積臨床妊娠率，但通過檢測結果可判斷出理論值：表型正常的胚胎存在于11個促排卵周期中，也就是說如果移植這些胚胎，最多能夠使11個周期獲得臨床妊娠，PGT累積臨床妊娠率最高為35.48%(11/31)；完全正常胚胎存在于9個促排周期中，同理推算，PGT累積臨床妊娠率最高為29.03%(9/31)。而在90個PGT-A周期中，有可用胚胎的周期81個，PGT累積臨床妊娠率最高可達90%(81/90)。根據我中心2015年至2016年數據顯示，PGT-A患者，累積臨床妊娠率為70.75%。由此可見，PGT-M患者累積臨床妊娠率遠低于PGT-A患者。

綜上所述，PGT-M患者要經歷胚胎染色體非整倍性篩查及單基因病診斷雙重篩選，使得可用胚胎驟減，最終導致累積臨床妊娠率降低。隨著檢測患者增多，統計數據量的增大，我們將繼續關注此類患者的累積臨床妊娠率，驗證并進一步尋找可能的形成原因，為臨床遺傳咨詢提供理論參考。