表觀遺傳修飾與胚胎著床

馬妮，張昌軍，3，刁紅錄，3*

表觀遺傳學是指在不改變DNA序列的前提下研究基因在轉錄能力及表觀遺傳性方面的變化[1]。在哺乳動物胚胎發育過程中父系和母系基因組必須經歷表觀基因重塑及轉錄模式的改變從而才能促進胚胎的正常發育。在受精過程中雌、雄配子各自表達其表觀遺傳特異型，受精卵是一種比較獨特的細胞，因為它有從一個細胞分化發育為任何一種組織的能力，為了實現多能性，生殖細胞的表觀遺傳經歷重設后胚胎基因組必須被轉錄因子在空間狀態下被高度修飾。胚胎著床同樣需要呈現接受態的子宮才能保證胚胎的順利植入，影響子宮內膜接受態的形成因素眾多，以下我們主要介紹表觀遺傳修飾在胚胎發育及著床過程中的影響。

一、表觀遺傳學與胚胎發育

表觀遺傳學修飾包括組蛋白修飾、DNA甲基化、基因印記、非編碼RNA和X染色體失活等[2]。現在研究主要集中于組蛋白修飾和DNA甲基化與胚胎發育的關系，首先簡要介紹表觀遺傳修飾在胚胎發育中的作用。

1.組蛋白修飾與胚胎發育

在真核生物中，染色體內DNA和組蛋白結合所形成的染色質中有一個重復的核小體單位，它是由146對堿基纏繞八個組蛋白后卷曲和壓縮后形成的[3]。核心組蛋白包括H2A，H2B，H3和H4，連接組蛋白包括H1和H5，核心組蛋白形成組蛋白的核心，連接組蛋白是連接DNA的。組蛋白有多種轉錄后修飾包括組蛋白上一些氨基酸乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等修飾[4]。組蛋白氨基酸末端突出于核小體表面，為了基因的轉錄它必須從物理結構上發生改變使DNA可以容易或者不容易結合轉錄因子從而實現基因的表達。

(1)組蛋白乙酰化與胚胎發育：在胚胎著床前組蛋白不同殘基發生乙酰化修飾在胚胎發育時間窗中對染色質重構有重要的作用，H3不同殘基乙酰化在胚胎著床前的變化是不同的，在胚胎卵裂時可以檢測到H3K64ac，H3K56ac的豐富表達，但是H3K122ac僅有微弱的表達，說明不同組蛋白修飾在胚胎早期發育中發揮的作用不同[5]。蛋白修飾中研究最多的是組蛋白乙酰化，乙酰化后組蛋白與DNA結合疏松，這樣有利于DNA與轉錄因子的結合，相反，組蛋白去乙酰化使組蛋白與DNA緊密結合不利于基因的轉錄，這兩種狀態是由組蛋白乙酰化轉移酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)相互作用而達到生物學平衡[6]。組蛋白乙酰化可以誘導DNA復制和轉錄，HDAC1可以影響小鼠胚胎的發育，如果在胚胎發育早期缺乏HDAC1就會使胚胎發育延遲或停止[7]。

(2)組蛋白甲基化與胚胎發育：組蛋白翻譯后修飾被廣泛研究，例如在胚胎基因組激活中H3K9me3和H3K27me3被認為是轉錄活性的一種抑制性標志，而H3K4me3、H3K36me3和H3K9ac被認為是轉錄活性的一種激活性標志[8]。在早期發育的胚胎中H3K4me3高表達且表達于父系基因組[9]，而胚胎發育為1細胞到4細胞是胚胎基因激活期，H3K4me3是從配子融合形成胚胎開始出現的，在受精卵中表達降低，隨后在胚胎發育為2細胞時表達升高直至囊胚期[8]。在母系基因組及卵母細胞中發現有一種非經典的H3K4me3(nc H3K4me3)存在，并可以與大部分DNA甲基化區域重復，在2細胞胚胎時經典H3K4me3開始建立而nc H3K4me3的表達慢慢消失，說明在胚胎發育早期H3K4me3在父系基因組和母系基因組都發揮一定的生物學功能，與DNA甲基化有一定的聯系并且在哺乳動物早期發育中是動態變化的[9]。在胚胎發育過程中的囊胚期前H3K27me3表達較囊胚期后低，說明H3K27me3在分化的細胞中表達高于分裂細胞，可能的原因是多能性基因的啟動子處被甲基化而無法轉錄[10]。

合子基因激活(ZGA)主要發生在1細胞和2細胞階段，這對正常個體的發育是非常重要的，胚胎植入前基因激活(MGA)主要發生在4細胞到8細胞階段，轉錄因子主要在這個階段開始表達并調控內外胚層的發育[11]。CHD1(chromodomain helicase DNA binding protein 1)是ATP酶依賴性染色質重塑因子家族的成員，它可以使H3K4三甲基化，并促進mRNA的轉錄，對維持小鼠胚胎干細胞多能性必不可少[12]。在外胚層發育過程中CHD1可以促進基因轉錄使外胚層快速發育，如果敲除Chd1基因后小鼠胚胎就會在第6.5天的時候因為外胚層發育障礙而停止發育[13]。在小鼠胚胎中敲除Chd1基因后會使植入的胚胎死亡，有研究認為，在小鼠胚胎早期發育中如果抑制Chd1基因的轉錄因子Pou5f1、Nanog和Cdx2，基因激活(MGA)就開始急劇下降，而調節以上轉錄因子的Hmgpi和Klf5在ZGA期被顯著抑制，Hmgpi的表達被抑制直至囊胚期，而Klf5的表達抑制在桑葚胚期被解除，說明在基因激活階段主要是通過Hmgpi和Klf5調節轉錄因子而影響CHD1的表達進而控制小鼠胚胎的發育與存活[13]，還有研究認為，CHD1通過改變染色體結構而影響基因的表達，說明CHD1對于小鼠早期胚胎的正常發育必不可少。

在核心組蛋白中H2A是變化最多的一種核心蛋白，而在H2A中H2A.Z是研究最多的一種，H2A.Z是最先發現與哺乳動物發育有密切關系組蛋白變體，雖然其序列高度保守，但是它在不同生物中扮演的角色不同。H3K36me3可能與基因轉錄延長有關，H3K36甲基化轉移酶通過Rbp1最大的亞基CTD與RNA聚合酶II相互作用影響基因轉錄[14]。早期胚胎發育的特點是細胞的多能性和染色質結構的動態變化，在小鼠胚胎發育為2細胞階段，H2A.Z乙酰化水平和H3K36me3表達水平下降，2細胞胚胎為胚胎基因組主要的激活時間(在牛胚胎發育時胚胎基因組激活時間為8細胞階段)，說明這些活性標志與胚胎基因組轉錄激活有關系，如果小鼠缺乏H2A.Z會使胚胎內細胞團增殖和分化有缺陷而導致胚胎著床前死亡[15]。

2.DNA甲基化與胚胎發育

DNA甲基化是DNA復制后的一個共價修飾調節，一個甲基化基團結合到核苷酸的CpG島處(位于鳥嘌呤后的胞嘧啶)，它作為DNA和轉錄因子之間的物理屏障，或者吸引酶和蛋白從而減少轉錄因子和DNA之間的結合[16]。

DNA甲基化轉移酶(DNMTs)對促進DNA甲基化必不可少，一旦DNA序列被甲基化那么就會有一些蛋白識別甲基化的胞嘧啶并使染色質重塑從而抑制基因轉錄，與組蛋白修飾一樣，DNA甲基化轉移酶對于胚胎的正常發育必不可少，DNA甲基化在胚胎著床前也會發生一系列變化，成熟的精子和卵母細胞中DNA都被高度甲基化幾乎沒有轉錄活性，在內細胞團中DNA甲基化水平高于外胚層，說明甲基化可以調節基因轉錄活性，影響細胞的多能性及分化能力[17-18]。在人類輔助生殖技術中發現異常胚胎和冷凍胚胎中DNMTs的表達比新鮮胚胎中低，說明異常發育和低溫保存可能影響胚胎中DNMTs的表達[19]。在哺乳動物中最常發生的DNA甲基化是在DNA結構中第5個鍵發生甲基化(5mC)，盡管在小鼠卵母細胞中發現非CpG甲基化水平表達顯著但是其功能未知，5mC的作用在各個方面研究較多，在哺乳動物發生發育過程中，DNA甲基化是表觀遺傳作用中比較重要的一種修飾，當細胞分化發育為不同譜系時5mC將會引導細胞分化并作為一種障礙阻止其向未分化細胞分化[20]。

3.基因印記與胚胎發育

是指來自父系或母系的等位基因在子代中有不同的表達方式。在父系基因印記中父系等位基因被表觀遺傳修飾而不發生轉錄，這樣就會使在子代中只有單母系等位基因的表達；而在母系印記基因中，母系等位基因被表觀遺傳修飾而不發生轉錄，這樣就會使在子代中只有單父系等位基因的表達，基因印記通常被組蛋白修飾[21]。哺乳動物每次生殖周期中配子將會重新建立印記基因，在受精后的第11.5天原始生殖細胞將會發生去甲基化以抹去遺傳父母的印記，在第13天印記被完全抹去后會根據胎兒性別等特征重新發生基因印記[22]。

4.非編碼RNA與胚胎發育

非編碼RNA是指不翻譯成蛋白即不參與基因轉錄的RNA，包括很多種如snRNA、snoRNA、microRNA，主要功能是參與DNA轉錄后表達的調節，非編碼RNA中當前研究最多的是miRNA，它主要是結合到mRNA序列上阻止其翻譯從而抑制DNA的表達[23]。在早期胚胎中發現母系遺傳的miRNA相當豐富，小鼠胚胎2細胞階段時miRNA的表達明顯升高[24]，在小鼠胚胎發育中如果缺乏Dicer酶(是RNAi發揮作用過程中重要的物質)那么miRNA將無法發揮作用，這樣就會減少小鼠胚胎干細胞的數量，說明miRNA可以維持干細胞的多能性，參與胚胎的發育[25]。

5. X染色體失活與胚胎發育

在女性胚胎中有2條X染色體，其中將會隨機選擇一條失活，而參與X染色體失活的表觀遺傳包括不同的組蛋白修飾和DNA甲基化，它可以參與胚胎干細胞多能性的維持[26]。

二、表觀遺傳修飾與子宮內膜容受性

子宮內膜容受性是胚胎著床和成功妊娠的先決條件，子宮內膜接受態的形成包括很多復雜的轉錄過程，該過程由雌孕激素以及眾多分子的相互作用完成的，其中一些精細調節是由表觀遺傳修飾所調控的。容受性的子宮內膜是一種正常的生理狀態，它主要是為胚胎順利著床做準備，在人類、小鼠和牛的發情周期中子宮內膜變化都涉及以上分子的表達[27]，體內和體外產生的胚胎分別在形態、功能和轉錄水平都有差異，它們成功植入需要激活子宮內膜不同的基因和轉錄調節機制，這些調控可能是通過基因的表觀遺傳學實現的。

在月經周期中，子宮內膜發生蛻膜化(子宮內膜基質細胞形態和功能上的改變)對于其接受態的形成和胚胎植入必不可少，而表觀遺傳修飾可能影響月經周期中子宮內膜相關基因的表達從而導致基質細胞發生蛻膜化，異常的表觀遺傳修飾可能會導致蛻膜化異常影響胚胎植入。體外表觀遺傳修飾HDAC(修飾組蛋白去乙酰化)參與月經周期的變化，HDAC抑制劑Trichostatin A(TSA)作用于子宮內膜后可使上皮細胞凋亡、基質細胞發生形態學變化及蛻膜化標志蛋白的表達，例如：胰島素樣生長因子(IGFBP-1)、催乳素等都可以促進基質細胞發生蛻膜化[28]，在蛻膜化中發現H3、H4發生乙酰化并且H4乙酰化與卵巢類固醇激素密切相關可以激活IGFBP-1的啟動子[29]。DNA甲基化可以調節一些與子宮內膜接受態相關基因的表達，例如可以使Cdh1，Pgr，Esr，Lif等基因啟動子處甲基化，影響子宮內膜接受態的形成[30]。有研究認為E-cadherin對于子宮內膜接受態的形成至關重要，而它的表達又受到DNA甲基化轉移酶的調節，單獨抑制DNMT-1、-3A、-3B分子后對E-cadherin的表達無影響，但是聯合抑制三種DNMT-1、-3A、-3B分子后就會使E-cadherin的表達上升并促進子宮內膜向接受態轉變，說明了不同價甲基化轉移酶均參與了子宮內膜接受態的形成[31]。

在細胞分化發育過程中PRC1可以調節一些基因的表達，多梳抑制復合體1(Polycomb repressive complex 1，PRC1)成員(Cbx2、Cbx4、Ring1B和Rybp)可以調節組蛋白修飾(H3K27me3和H2AK119ub1)影響子宮組織蛻膜化中多倍體的發育，在小鼠胚胎著床前體外注射PRC1抑制劑PRT4165后觀察小鼠胚胎著床情況，發現藥物處理組和對照組無明顯的區別，說明PRC1對于胚胎與子宮黏著的影響較小，但是發現在PRT4165處理后小鼠早期妊娠蛻膜化中的多倍體形成被破壞[32]。

miRNA是重要的轉錄調節者可以編碼高度進化的RNAs，長度大約有22個核苷酸，可以通過降解或抑制目標mRNA的表達，也是子宮內膜容受性的潛在調節者，miRNA-mRNA調控系統與胚胎著床有關，有研究認為miR-30b，miR-30d，miR-494在子宮內膜容受性形成過程中發揮著重要的作用，在接受態的子宮內膜中miR-30b，miR-30d高表達，而miR-494和miR-923低表達，miRNA在調節子宮內膜接受態形成過程中通過不同的途徑參與其中，例如Wnt信號通路、軸突傳導信號、ERK/MAPK信號通路、TGF-β信號通路、p53信號和白細胞外滲信號傳導途徑等[33-34]。

幾種良性的婦產科疾病如子宮內膜異位癥、子宮肌瘤、輸卵管積水、多囊卵巢綜合征等都可以導致生殖能力下降和影響子宮內膜接受態的形成，而DNA甲基化轉移酶與組蛋白乙酰化修飾可以影響胚胎植入相關基因的表達，例如LIF、HOXA10等[35]。在上面所提的幾種疾病中都發現在胚胎著床窗口期的內膜中HOXA10(孕激素作用的靶基因)的表達較正常降低，有研究認為在子宮內膜異位癥當中DNA甲基化轉移酶表達升高，它可以沉默HOXA10的啟動子使HOXA10的表達下降，HOXA10的缺乏可以導致胚胎著床失敗和子宮內膜接受態的形成受阻[36]。有研究認為在胚胎植入子宮的過程是HOXA10調控的兩個過程，第一個過程是胚胎著床前HOXA10高表達有利于基質細胞轉變為蛻膜化細胞，第二個過程是蛻膜化細胞中HOXA10的表達下降有利于胚胎的浸潤，研究認為在滋養層細胞中LIF和IL6大量產生后以旁分泌的形式刺激STAT3和MMP的產生以降低HOXA10的表達，STAT3和MMP的高表達有利于促進滋養細胞向子宮內膜的浸潤[37]。 所以可以認為表觀遺傳修飾中的DNA修飾 、組蛋白修飾、非編碼RNA參與子宮內膜蛻膜化的形成對子宮內膜接受態的形成有重要的作用。

三、展望

盡管在哺乳動物著床前基因的轉錄序列已經被確認，但是理解分子的相互作用可以更好的認識在胚胎著床前轉錄的進行。精子和卵母細胞發育并形成受精卵的過程中它們各自的基因高度甲基化后發生轉錄沉默，這就保持了受精卵的全能性，受精卵發育過程中基因發生表觀遺傳修飾后又恢復了轉錄活性，從而行使生物學功能。哺乳動物精卵融合過程中原始生殖細胞發生時間和空間的表觀遺傳修飾，DNA修飾和染色質修飾決定哪些基因區域先開放發生轉錄，哪些先關閉發生沉默。但是有關表觀遺傳學在哺乳動物生殖，尤其是在子宮內膜容受性建立的過程還需深入探索，這樣才會更好地為輔助生殖技術提供理論基礎，才能提高妊娠率，造福于人類不孕不育事業。