樺褐孔菌三萜的酰化對其抗腫瘤活性的影響

鄧麗穎，楊燦宇，閆亞輝，李佳偉，岑如月，趙 輝

（1．河南省輝縣市人民醫院，輝縣 453600；2．河南大學藥學院，開封 475004）

樺褐孔菌[Inonotus obliquus（Fr．）Pilat]為擔子菌亞門、多孔菌目、刺革菌科的藥用真菌，在亞洲、歐洲及北美洲均有分布，它作為抗腫瘤藥物在民間使用已有很長歷史[1－2]。現代藥理學實驗證明樺褐孔菌可抑制NCI－H460人大細胞肺癌細胞、HT29人結腸癌細胞及B16－F10小鼠黑色素瘤細胞等多種腫瘤細胞的生長，并可逆轉Hep2/R肺癌細胞的多藥耐藥性[3－4]。樺褐孔菌的化學成分主要為羊毛脂烷型三萜類化合物[5－7]，其中以 inotodiol和 trametenolic acid 2個化合物的含量最高，他們也是樺褐孔菌中眾多其他次生代謝產物的生物原料。本實驗擬從樺褐孔菌中分離制備inotodiol、trametenolic acid及抗腫瘤活性化合物inonotusane A，并以此為原料制備其酰化產物，進而考察其結構變化前后的抗腫瘤活性，為樺褐孔菌三萜的結構修飾方向提供參考，inotodiol、trametenolic acid及inonotusane A的結構見圖1。

1 儀器與材料

AVANCE400M核磁共振儀（1H HNMR:400MHz，13CNMR:100 MHz，德國 Bruker公司）；高分辨質譜（安捷倫公司）；VERTEX70傅立葉變換紅外光譜儀（Bruker公司）；XT6顯微熔點測定儀（北京市科技電光儀器廠）；制備型高效液相色譜（HPLC）儀（日本島津），制備型HPLC色譜柱為Shim－pack PREP－ODS（H）KITcolumn（250 mm ×20 mm,5μm）；十八烷基鍵合固定相（Rp－18）柱層析材料（Merck公司），Rp－18高效薄層預制板（Merck公司），柱色譜用硅膠200～300目（青島海洋化工廠）；色譜甲醇（天津市四友精細化學品有限公司），本實驗所用其他化學試劑均為分析純。

本實驗所用藥材采自吉林省琿春地區，由本實驗室鑒定為 Inonotus obliquus（Fr．）Pil。紫杉醇注射液（5 mL,30 mg）購自海南中化聯合制藥工業股份有限公司，批號20130806。

2 實驗方法

2.1 原料化合物的分離與結構鑒定 取干燥粉碎的樺褐孔菌子實體10 kg，采用95%乙醇回流提取5次，每次1 h，得到乙醇提取物430．5 g。將乙醇提取物均勻分散于水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取（15 L×3）得到各萃取物。將乙酸乙酯萃取物（198．2 g）用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯）粗分為Fr．1～10共10部分。將餾分Fr．2再用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯μ從100∶0到0∶100比例梯度洗脫）分離得到inotodiol（1）；將餾分Fr．3也用硅膠柱層析（石油醚－乙酸乙酯）分為 3 部分 Fr．3．1～3．3，進而將Fr．3．1進行ODS開放柱層析（甲醇－水）和制備型HPLC（甲醇∶水為77∶23）進行分離，得到inonotusane A（3）；將餾分 Fr．4 采用 ODS 開放柱層析分為 Fr．4．1～4．5，再將 Fr．4．3 采用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 13∶0．95∶0．05） 分離，得到 trametenolic acid（2）。

2.2 目標化合物的制備 化合物1（a－c）的制備：稱取干燥的inotodiol（1）220 mg置于100 mL的圓底燒瓶中，加入約22 mL氯仿將化合物inotodiol溶解，另取506 mg的干燥琥珀酸酐，使用約8．8 mL N，N－二甲基甲酰胺（DMF）溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入吡啶10μL和4－二甲氨基吡啶（DMAP）適量，攪拌下加熱至回流約7 h，TLC監測反應物反應完全。用旋轉蒸發儀蒸出氯仿后，加入蒸餾水30 mL，用稀 HCl調 pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×20 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用70 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機相蒸干，硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 20∶0．95∶0．05）分離純化后，用制備型HPLC分離，分別得到化合物1a（甲醇∶水為 77∶23,tR164．8 min）、1b（甲醇∶水為 77∶23,tR65．5 min）和 1c（甲醇∶水為 84∶16,tR30．5 min）。

化合物2a的制備：稱取干燥的trametenolic acid（2）320 mg置于100 mL的圓底燒瓶中，加入約10 mL吡啶將化合物trametenolic acid溶解，另取560 mg的干燥琥珀酸酐，用約10 mL DMF溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入DMAP適量，攪拌下加熱至83℃，反應約17 h，TLC監測反應物反應完全。將反應液用旋轉蒸發儀旋蒸1h后，加入蒸餾水20mL，用稀 HCl調 pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×20 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用70 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機相蒸干，ODS開放柱層析（甲醇∶水為90∶10）分離純化后，用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 9∶0．95∶0．05）分離，得到化合物2a。

化合物3a的制備：稱取干燥的inonotusane A（3）12 mg置于25 mL的圓底燒瓶中，加入約3 mL氯仿將化合物inonotusane A溶解，另取25 mg的干燥琥珀酸酐，用約1 mLDMF溶解后，加入圓底燒瓶中，再加入吡啶10μL和DMAP適量，攪拌下加熱至回流約10 h，TLC監測反應物反應完全。用旋轉蒸發儀蒸出氯仿后，加入蒸餾水5 mL，用稀HCl調pH 2～3，再用乙酸乙酯（4×5 mL）萃取，合并乙酸乙酯萃取液，用20 mL飽和鹽水洗滌4次，再加入無水硫酸鈉干燥。次日，將有機相蒸干，制備型HPLC（甲醇∶水為95∶5）分離純化后，用硅膠柱層析（氯仿∶甲醇∶水為 8∶0．95∶0．05）分離，得到化合物 3a。

圖1 目標化合物1（a-c）、2a和3a的合成路線Fig.1 Systhesisrouteof the objective compounds1(a-c),2a and 3a

圖2 化合物3a的17-側鏈的NOESY相關情況Fig.2 Key NOESY correlations of 17-sidechain in 3a

2.3 體外抗腫瘤活性 采用噻唑藍（MTT）法測試化合物 1－3 及 1a、1b、1c、2a、3a 對 A549 人肺癌、Hela人宮頸癌、MCF－7人乳腺癌及4T1小鼠乳腺癌細胞株的抑制活性。實驗中，受試化合物均用二甲基亞砜（DMSO）溶解，配制成10 mmol/L的母液，－20℃儲存，臨用前于37℃恒溫解凍后，采用不加血清的培養基將母液稀釋至不同濃度；對照品采用紫杉醇注射液，其中紫杉醇的濃度為7 mmol/L，將其按藥品說明書進行儲存，臨用前采用不加血清的培養基將其稀釋至不同濃度。

取對數生長期細胞，制備細胞懸液后，將細胞懸液均勻接種于96孔板中，每孔加入100μL，將細胞放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養18～24 h；待細胞貼壁后，將培養基棄去，加入充分混勻的含有不同濃度藥物（待測化合物及陽性對照化合物）的培養基至96孔板中，每孔加入100μL，藥物濃度分別為 1、5、10、30、50 μmol/L，每種濃度設4個復孔，其中，調零組不接種細胞，空白組接種細胞但不加藥；將細胞放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養48 h；將培養基吸出，每孔加入MTT試劑100μL，將細胞放置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中繼續培養4 h；吸出上清液，每孔加DMSO 100μL，振蕩 5～10 min，在酶聯免疫檢測儀 490 nm處測量各孔的吸光度值，計算腫瘤細胞的抑制率及化合物的IC50值。

3 實驗結果

化合物 1：白色粉末（1．2 g），ESI－MSm/z：465．57[M+Na]+,481．43[M+K]+，其1H 和13CNMR 數據分別見表1和表2。通過與文獻報道對照，將其鑒定為inotodiol[8]。

化合物 2：白色粉末（802 mg），ESI－MS m/z：455．62[M－H]－，其1H 和13CNMR 數據分別見表 2 和表3。通過與文獻報道對照，將其鑒定為trametenolic acid[9]。

化合物 3：白色粉末 （23 mg,tR43．7 min），HRESIMS確定其分子式為C30H50O3（[M+Na]+,m/z 481．365 4;calcd 481．365 8），其1H 和13CNMR 數據分別見表2和表3。通過與文獻報道對照，將其鑒定為inonotusane A[10]。

化合物 1a：白色粉末（20 mg），回收率 7．4%，HRESIMS確定其分子式為C34H54O5（[M+Na]+,m/z 565．386 8;calcd 565．386 9）。IR（KBr）νmax:3 450,2 924,1727,1454,1375,1166cm－1。1HNMR（400MHz，CD3OD）數據見表1，經與原料化合物1對照，并參考文獻[11]，3－H 的化學位移由 δH3．24（dd,J=9．2,4．4 Hz）增大至 δH4．48（dd,J=9．2,7．2 Hz）；同時，化合物1a增加了4個質子信號δH2．59（4H,m）。13C NMR（100 MHz，CD3OD）δ：174．2,135．9,135．7,133．2,123．6,82．6,74．9,52．1,50．7,46．0,44．2,39．0,38．2,36．5,32．3,32．1,30．7,30．1,28．5,28．5,27．6,26．1,25．1,24．7,22．1,19．7,19．3,18．0,17．1,16．2,13．1。

表 1 化合物 1 和 1（a-c）的 1H-NMR（400 MHz，δ in ppm,J in Hz）Tab.1 1H-NMR data of compounds1,1a,1b and 1c(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

化合物 1b：白色粉末（30 mg），回收率 11．1%，HRESIMS確定其分子式為C34H54O5（[M+Na]+,m/z 565．386 6;calcd 565．386 9）。IR（KBr）νmax:3 448,2 924,1 726,1 454,1377,1 169,1 058 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數據見表1，經與原料化合物1 對照，并參考文獻[11]，22－H 的化學位移由 δH3．68（1H,m）增大至δH4．90（1H,m）；同時，化合物1b增加了4 個質子信號 δH2．55（4H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：174．0,136．2,135．6,134．4,121．9,79．7,78．6,52．0,50．7,46．1,41．2,40．0,38．3,37．0,32．3,32．0,30．9,28．7,28．5,28．0,27．7,27．7,26．0,24．7,22．1,19．7,19．5,18．0,16．2,16．2,13．8。

化合物 1c：白色粉末（103 mg），回收率 32．2%，HRESIMS確定其分子式為C38H58O8（[M+Na]+,m/z 665．402 8;calcd 665．403 0）。IR（KBr）νmax:3 385,2 946,2 836,1 731,1 371,1 171,1 024 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數據見表1，經與原料化合物1對照，并參考文獻[11]，3－H 的化學位移由 δH3．24（dd,J=9．2,4．4 Hz）增大至 δH4．48（dd,J=8．8,7．6 Hz），同時，22－H 的化學位移由 δH3．68（1H,m） 增大至 δH4．91（1H,m）；此外，化合物 1c 增加了 8 個質子信號δH2．57（8H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：176．0,176．0,174．0,173．8,135．8,135．7,134．5,121．9,82．5,78．5,52．0,50．7,46．1,41．2,39．0,38．2,36．5,32．2,32．0,30．6,29．9,28．5,28．0,27．6,27．6,26．1,25．1,24．8,22．1,19．7,19．3,18．1,17．1,16．2,13．8。

化合物 2a：白色粉末（150 mg），回收率 38．4%，HRESIMS 確定其分子式為 C34H52O6（[M－H]－,m/z 555．368 8;calcd 555．368 6）。IR（KBr）νmax:2 950,1716,1657,1375,1266,1179cm－1。1HNMR（400MHz，CD3OD）數據見表3，經與原料化合物2對照，并參考文獻[11]，3－H 的化學位移由 δH3．00（1H,m）增大至 δH4．39（1H,m）；同時，化合物 2a 增加了 4 個質子信號 δH2．50（4H,m）。13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：180．5,176．0,174．1,135．7,135．7,133．0,124．9,82．6,52．0,50．7,49．3,48．5,45．5,39．0,38．2,36．5,33．8,31．5,30．6,30．1,29．9,28．5,28．2,27．5,27．0,26．0,25．1,24．8,22．0,19．7,19．2,17．8,17．1,16．5。

化合物 3a：白色粉末（4 mg），回收率 27．4%，mp 149．5～150．6 ℃，HRESIMS 確定其分子式為 C34H54O6（[M+Na]+,m/z 581．381 7;calcd 581．381 8）。IR（KBr）νmax:3 436,2 952,1 645,1 452,1 372,1 160,1 017,667 cm－1。1H NMR（400 MHz，CD3OD）數據見表 3，與原料化合物3對照顯示，3－H的化學位移由δH3．24（dd,J=11．6,4．4Hz）增大至 δH4．38（dd,J=8．8,7．2Hz）；同時，化合物3a增加了4個質子信號δH2．49（4H,m）。13C NMR （100 MHz，CD3OD）δ：176．0,174．1,136．1,135．6,82．7,76．3,73．4,54．5,52．1,50．6,49．9,45．6,44．6,39．0,38．2,36．6,32．2,31．2,30．6,30．6,30．0,30．0,29．4,29．1,28．5,28．2,27．6,25．1,25．0,22．1,19．7,19．3,17．6,17．1。為證實 inonotusane A（3）反應生成3a后，其側鏈上的五元環構型未發生變化，通過HSQC譜對目標化合物3a的1H NMR和13C NMR進行歸屬后（表2），進一步分析其NOESY譜（圖 2）可見 H－17/H3－30相關峰，表明 H－17為 α－構型；另外可見 H－21/H－20和H－21/H3－18相關峰，而未見H－20/H－17相關峰，證實了21β－H和22β－H；同時H－21/H－24相關峰證明H－24為β－構型。化合物 1、2、3、1a、1b、1c、2a、3a的結構見圖 1。

MTT實驗結果如表4所示，化合物1的3－位、22－位酰化后（1a,1b,1c）對A549和4T1腫瘤細胞的抑制活性均增強，此外，而其3－位酰化后（1a）還大大增強了對MCF－7腫瘤細胞的抑制活性。化合物2酰化后對活性無影響。化合物3的3－位酰化后對A549、MCF－7及4T1細胞的抑制活性均明顯增強，其中對A549表現出最強的抗腫瘤活性（IC50=9．53 μmol/L）。

4 討論

所有化合物在結構修飾前后對HeLa細胞的抑制活性均未發生變化，而對其他腫瘤細胞的抑制活性卻明顯增強（2a除外），推測HeLa細胞對于化合物結構中引入此類酰基并不敏感。2和2a對所有腫瘤細胞均無抑制活性，說明化合物的酰化并不能增強活性，應嘗試其他的結構修飾方式。1a、1b、1c和3a均比其原料化合物具更強的抗腫瘤活性，故inotodiol（1）的 3 位－及 22－位、inonotusane A（3）的3－位均有進一步研究的價值，但因他們均為樺褐孔菌的獨有成分，目前尚未發現其在其他天然產物中存在。因此，原料問題是其結構修飾工作的關鍵之一。

天然化合物的結構修飾往往是獲得理想活性物質的一個有效手段，其中，三萜類化合物所表現出的廣泛的抗腫瘤活性使其成為重要的先導化合物來源，如對鼠纖維肉瘤細胞Meth－A、Lewis型肺癌細胞LLC、乳腺管癌細胞T－47D、惡性肉瘤細胞S180和肝癌細胞Hep G2等都具有較強的細胞毒性，能抑制肝癌細胞的生長并誘導細胞發生凋亡[12－15]。對于三萜類先導化合物的結構修飾及抗腫瘤構效關系研究也受到關注，如同為羊毛脂烷型三萜的靈芝酸的抗腫瘤構效關系研究表明，靈芝酸A、F和H對乳腺癌細胞MDA－MB－231轉移的抑制作用，得出結論：C－3、C－7和 C－15 位置的羥基化有助于提高該類三萜結構對乳腺癌細胞轉移的抑制活性[16]。

表2 化合物1-3、3a的13C-NMR數據（100 MHz）及3a的1H-NMR數據（400 MHz,δin ppm,Jin Hz）Tab.2 13C-NMR data of 1-3 and 3a(100 MHz)and 1H-NMR data of 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

表 3 化合物 2、2a、3 和 3a 的 1H-NMR（400 MHz，δ in ppm,J in Hz）Tab.3 1H-NMR data of compounds 2,2a,3 and 3a(400 MHz,δin ppm,J in Hz)

表4 化合物1-3、1（a-c）、2a和3a對受試腫瘤細胞的抑制作用Tab.4 IC50 of 1-3,1(a-c),2a and 3a on the tumor cell lines μmol/L

因此對樺褐孔菌三萜的結構修飾及構效關系研究任重而道遠，也希望本研究能為抗腫瘤藥物的研究進程貢獻新力量。