腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立及評(píng)價(jià)指標(biāo)*

劉 璐 ，曹世杰 ，程麗娜 ，邱 峰 ，3，康 寧

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院生物化學(xué)教研室，天津 300193；2.天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)教研室，天津 300193）

肥胖和2型糖尿病均與胰島素抵抗關(guān)系密切[1]。在糖尿病的發(fā)展中，脂肪組織發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，炎癥因子與脂肪組織內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)相互作用，引起胰島素抵抗，最終導(dǎo)致2型糖尿病發(fā)生[2]。研究表明，促炎細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）可導(dǎo)致脂肪組織或系統(tǒng)性炎癥的產(chǎn)生，最終可能引起胰島素抵抗[3-4]，可用于建立體外胰島素抵抗模型。然而，縱觀已發(fā)表的有關(guān)TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗造模文獻(xiàn)[5-8]，有關(guān)TNF-α劑量及作用時(shí)間對(duì)造模結(jié)果的影響以及模型建成的評(píng)價(jià)指標(biāo)尚不完全清楚。

據(jù)報(bào)道，在胰島素刺激下，脂肪細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4（GLUT4）會(huì)從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜上，而在2型糖尿病中這種轉(zhuǎn)位功能會(huì)減弱[9]，因此，本研究采用TNF-α體外誘導(dǎo)法建立3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型，考察TNF-α造模用藥劑量及作用時(shí)間，并以GLUT4蛋白表達(dá)結(jié)合膜轉(zhuǎn)位的變化作為胰島素抵抗模型是否建立的指標(biāo)。

1 材料

1.1 細(xì)胞 小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1購于北京醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；胰蛋白酶（BIOSHARP）；胎牛血清（TBD）；胰島素（丹麥諾和諾德公司）；地塞米松（Sigma）；1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤（Sigma）；羅格列酮（Sigma）；TNF-α（Pepro Tech）；葡萄糖檢測(cè)試劑盒（北京普利萊公司）；BCA試劑盒（Solarbio）；抗體：GLUT4（SAB），辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（中杉金橋公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力申有限公司）；酶聯(lián)免疫分析儀（美國(guó)BioTek）；倒置顯微鏡（Nikon）；Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)（Perkin Elmer）。

2 方法

2.1 3T3-L1前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化 當(dāng)3T3-L1前脂肪細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)，使細(xì)胞接觸抑制48 h，然后進(jìn)行誘導(dǎo)分化，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有0.5 mmol/L的3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1μmol/L的地塞米松、10μg/mL的胰島素、3μmol/L的羅格列酮和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基。孵育48h后將培養(yǎng)液換成含有10μg/mL的Insulin、3μmol/L的羅格列酮和10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基再孵育48 h后換液，換成含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，每48 h換液1次，直至80%以上的細(xì)胞分化成熟。

2.2 油紅O染色法鑒定脂肪細(xì)胞 將誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗3次，然后用10%的甲醛溶液室溫固定1 h，移去固定液后用PBS洗3次，晾干細(xì)胞。加入3 mg/mL用異丙醇溶解的油紅O染液，室溫染色10 min，然后用水洗至少3次，每次5 mL，洗去殘?jiān)图?xì)胞縫隙中的染料，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 TNF－α誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞胰島素抵抗 取誘導(dǎo)分化成熟的3T3－L1脂肪細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，設(shè)立4個(gè)組，分別是：空白對(duì)照組、空白對(duì)照加胰島素組、模型組和模型加胰島素組。細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)液換為含有0．5%牛血清白蛋白的無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，于5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育8 h，然后將空白對(duì)照組的培養(yǎng)液換為含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，模型組換為加入5、10、15、20、25 ng/mL TNF－α并含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，分別作用48、72、96 h，期間空白對(duì)照組和模型組的培養(yǎng)基每24 h更換1次。最后，棄去原有培養(yǎng)基，用PBS洗1次，將空白對(duì)照組和模型組換為無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，空白對(duì)照加胰島素組和模型加胰島素組換為加入含有100 nmol/L胰島素的無血清低糖DMEM培養(yǎng)基，30 min后吸取上清液，用葡萄糖氧化酶法試劑盒檢測(cè)上清液中葡萄糖含量。

2.4 TNF－α對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞的毒性 取已建立好胰島素抵抗模型的3T3－L1脂肪細(xì)胞，吸棄上清液后，PBS清洗1次，然后每孔加入100μL 5 mg/mL的MTT溶液，在 5%CO2培養(yǎng)箱37℃孵育 2．5 h后，加入150μL二甲基亞砜溶解，震蕩10 min，于490 nm處測(cè)定吸光值。

2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)GLUT4蛋白在膜上的表達(dá)情況 細(xì)胞造模結(jié)束后，空白對(duì)照加胰島素組和模型加胰島素組分別加100 nmol/L的胰島素刺激30 min，去除培養(yǎng)液，收取細(xì)胞于1．5 mL的離心管中，按照膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。依據(jù)蛋白濃度取10μg總蛋白質(zhì)，以10%的SDS－PAGE膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法（100 V，3 h）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的TBST（含0．1%Tween20）室溫下封閉2 h后加入GLUT4的一抗，4℃過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫2 h，充分洗滌后用ECL顯影曝光，洗片后用激光掃描儀掃描，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，目的蛋白的相對(duì)含量為樣品組灰度/對(duì)照組灰度的值。

2.6 高內(nèi)涵技術(shù)檢測(cè)GLUT4的膜轉(zhuǎn)位 取誘導(dǎo)分化好的3T3－L1脂肪細(xì)胞，以1×104細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)黑板中，TNF－α按照10 ng/mL作用96 h，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照。4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS洗3次，5%胎牛血清封閉2 h，加入一抗孵育過夜。PBS洗3次，加入Dylight 550標(biāo)記的二抗工作液，37℃孵育1 h，含0．05%Tween20的PBS洗3次，再用PBS洗3次，加入Hoechst 33342孵育15 min，PBS洗滌細(xì)胞3次后，用Operetta高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，再通過Perkin Elmer公司提供的Columbus對(duì)視野中細(xì)胞熒光強(qiáng)度分布結(jié)構(gòu)等信息進(jìn)行量化統(tǒng)計(jì)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)操作至少3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 21．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析。P＜0．05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 油紅O作為脂肪特異性染色劑，能與中性脂肪結(jié)合使成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴著色，從而觀察脂肪細(xì)胞中脂肪的含量。從油紅O染色的結(jié)果可看出80%以上的細(xì)胞出現(xiàn)較大脂滴，呈現(xiàn)脂肪細(xì)胞表型，證明本研究采用的誘導(dǎo)分化方法切實(shí)可行。見圖1。

圖1 3T3-L1脂肪細(xì)胞油紅O染色圖(×200)Fig.1 Oil red O stained 3T3-L1 adipocytes(×200)

3.2 TNF－α作用時(shí)間和濃度變化對(duì)3T3－L1前脂肪細(xì)胞存活率及葡萄糖消耗的影響 5、10、15、20、25 ng/mL的TNF－α分別作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞48、72、96 h 后，采用噻唑藍(lán)（MTT）法測(cè)定細(xì)胞的存活率。5、10、15、20 和 25 ng/mL 的 TNF－α 作用 48、72 h及5、10 ng/mL作用96 h時(shí)細(xì)胞存活率均大于80%。進(jìn)一步，選擇存活率大于80%的劑量和時(shí)間，再用100 nmol/L的胰島素刺激細(xì)胞30 min，采用葡萄糖氧化酶法試劑盒檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞葡萄糖消耗量，見表1。與未加胰島素的正常對(duì)照組相比，胰島素刺激能夠顯著增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗。然而與加胰島素的正常對(duì)照組相比，胰島素刺激TNF－α作用96 h組細(xì)胞葡萄糖消耗顯著降低，并且呈劑量依賴。加胰島素與未加胰島素的TNF－α模型組間葡萄糖消耗沒有顯著差異，以上結(jié)果表明，10 ng/mL TNF－α誘導(dǎo)3T3－L1細(xì)胞96 h產(chǎn)生明顯的胰島素抵抗。見表2。

表1 3T3-L1脂肪細(xì)胞的存活率（x±s）Tab.1 Survival rate of 3T3-L1 adipocytes（x±s）%

表2 3T3-L1脂肪細(xì)胞的葡萄糖消耗（x±s）Tab.2 Effect of TNF-αon glucose consumption in 3T3-L1 adipocytes（x±s）mmol/L

3.3 TNF－α對(duì)3T3－L1脂肪細(xì)胞膜上GLUT4蛋白表達(dá)的影響 研究表明，GLUT4參與脂肪細(xì)胞對(duì)葡萄糖攝取，其可能是胰島素抵抗的重要分子機(jī)制[9]。利用Western blot考察TNF－α誘導(dǎo)的3T3－L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中細(xì)胞膜GLUT4的表達(dá)。由圖2可以看出，以Caveolin為內(nèi)參，無胰島素刺激時(shí)，與未造模組相比，加TNF－α組細(xì)胞膜上GLUT4顯著降低；在胰島素的刺激下，TNF－α組與只加胰島素組細(xì)胞膜GLUT4的表達(dá)有顯著減少，只加胰島素組與空白對(duì)照組相比細(xì)胞膜GLUT4有明顯的增加，蛋白定量結(jié)果與Western blot結(jié)果一致，見表3。可見，GLUT4膜蛋白表達(dá)下調(diào)與胰島素抵抗模型建立相關(guān)。

圖2 TNF-α對(duì)3T3-L1脂肪細(xì)胞膜上GLUT4表達(dá)的影響Fig.2 Effectsof TNF-αon GLUT4 expression in 3T3-L1 adipocyte membrane

表3 3T3-L1脂肪細(xì)胞膜上GLUT4的蛋白定量（x±s）Tab.3 Protein quantification of GLUT4 on 3T3-L1 adipocyte membrane（x±s）

3.4 高內(nèi)涵分析GLUT4的膜轉(zhuǎn)位 為了進(jìn)一步檢測(cè)TNF－α引起的胰島素抵抗是否導(dǎo)致GLUT4從胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)考察了GLUT4在細(xì)胞中的分布情況，并進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖3所示，空白對(duì)照組C中，GLUT4蛋白均勻分布在胞漿（黃色熒光），給予胰島素（100 nmol/L）作用15 min后，GLUT4一部分轉(zhuǎn)移到膜上（C+I）。模型組（M）細(xì)胞膜上GLUT4的表達(dá)較空白對(duì)照組（C）顯著減少，模型加胰島素組（M+I）與空白對(duì)照加胰島素組（C+I）相比，模型加胰島素組（M+I）的 GLUT4在膜上的表達(dá)量相對(duì)較少，與定量分析結(jié)果一致，見表4，由此可以看出TNF－α誘導(dǎo)的胰島素抵抗可以減少GLUT4的膜轉(zhuǎn)位。

4 討論

糖尿病是一種進(jìn)行性發(fā)展的慢性、終身性疾病。近年來，隨著人民生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年上升。據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的數(shù)據(jù)，2015年全球糖尿病的患病率為8．8%，患病人數(shù)達(dá)4．15億，死亡人數(shù)達(dá)到500萬，糖尿病已成為嚴(yán)重影響人類健康的主要慢性非傳染性疾病之一[10]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其發(fā)病主要與遺傳、環(huán)境因素等相關(guān)，胰島素抵抗在2型糖尿病發(fā)病、發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。

圖3 TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗對(duì)GLUT4的膜轉(zhuǎn)位的影響（×200）Fig.3 Effect of TNF-α-induced insulin resistanceon translocation of GLUT4 to theplasma membrane(×200)

表4 3T3-L1脂肪細(xì)胞膜上GLUT4蛋白的平均光密度值（x±s）Tab.4 Mean optical density of GLUT4 protein on 3T3-L1 adipocyte membrane（x±s）

胰島素抵抗既是2型糖尿病的特征又是導(dǎo)致2型糖尿病的主要原因[11]。遺傳因素、胰島素信號(hào)通路障礙、血清游離脂肪酸濃度增高或細(xì)胞內(nèi)脂肪含量增多、炎癥和氧化應(yīng)激等諸多因素均可引起胰島素抵抗[12]。

王春等[13]考察了111例2型糖尿病住院患者空腹血清TNF－α的水平后認(rèn)為糖尿病患者體內(nèi)的TNF－α與胰島素抵抗輕重程度呈正相關(guān)，進(jìn)一步說明TNF－α在胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的作用，并且肥胖是影響炎癥因子水平與胰島素抵抗的重要因素。其中，TNF－α主要由脂肪組織分泌產(chǎn)生，與慢性胰島素抵抗的發(fā)生關(guān)系密切。TNF－α可通過多途徑影響胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路來參與胰島素抵抗的發(fā)生[14]。在早期的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)TNF－α基因進(jìn)行剔除后，能夠增加體內(nèi)胰島素敏感性，從而改善糖脂代謝，間接說明TNF－α可能引起胰島素抵抗[15]。

據(jù)此，本研究采用TNF－α作用于3T3－L1脂肪細(xì)胞，從慢性低度的炎癥角度出發(fā)建立胰島素抵抗模型。Li等[16]與 Palaci－Osortega 等[17]采用了 10 ng/mL的TNF－α分別持續(xù)刺激分化成熟的3T3－L1脂肪細(xì)胞24 h和48 h建立胰島素抵抗模型；還有一些研究人員[18]采用2 ng/mL的TNF－α孵育96 h建立3T3－L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型。相反，有研究[19]表明，在TNF－α作用時(shí)間相對(duì)較短（24 h）時(shí)，脂肪細(xì)胞的胰島素依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)不受影響，胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)無顯著變化，據(jù)此，本研究中造模作用時(shí)間分別是48、72、96 h，發(fā)現(xiàn)不同的作用時(shí)間下高劑量的TNF－α均會(huì)使細(xì)胞存活率顯著降低；而TNF－α使用劑量過低均不能引起胰島素依賴性葡萄糖攝取的變化，也因此不能引起胰島素抵抗。同時(shí)，TNF－α作用超過96 h后也不會(huì)引起胰島素敏感性葡萄糖攝取下降。研究結(jié)果表明TNF－α誘發(fā)3T3－L1細(xì)胞胰島素抵抗模型的最佳方案為10ng/mL的TNF－α作用細(xì)胞96 h。鑒于上述文獻(xiàn)只是用葡萄糖攝取的方法檢測(cè)模型是否成立，并沒有考察TNF－α對(duì)細(xì)胞存活率的影響，胰島素抵抗模型在考察了造模藥TNF－α的作用時(shí)間及使用劑量的同時(shí)，考察TNF－α對(duì)細(xì)胞存活率的影響，以保證TNF－α的劑量不影響細(xì)胞活力，從而造成重現(xiàn)性好的胰島素抵抗模型。

有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，TNF－α與其他細(xì)胞因子在脂肪組織中直接或間接地影響著體內(nèi)葡萄糖代謝，TNF－α可直接抑制脂肪細(xì)胞中主要葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT4，使其表達(dá)下降而降低胰島素刺激的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，誘發(fā)胰島素抵抗[20]。而且，胰島素抵抗的肥胖病人脂肪細(xì)胞中GLUT4表達(dá)水平明顯下降。此外，TNF－α刺激下，GLUT4在2型糖尿病大鼠脂肪和肌肉細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低[21]。另一方面研究發(fā)現(xiàn)，Ishibashi等[22]通過elaidate誘導(dǎo)的3T3－L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中，細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上的GLUT4明顯下降，從而引起葡萄糖的消耗減少。這與以往Prasad等[23]的研究結(jié)果一致。Zierath等[24]研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌細(xì)胞長(zhǎng)期暴露于高濃度胰島素誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型中GLUT4活性降低或轉(zhuǎn)位障礙，且對(duì)生理濃度的胰島素刺激無反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗細(xì)胞模型中細(xì)胞膜上GLUT4蛋白表達(dá)量均會(huì)顯著減少[23-28]，GLUT4介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)是外周組織葡萄糖利用的限速步驟[29]。因此，推測(cè)GLUT4膜蛋白表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位可以作為判定TNF-α胰島素模型是否建立的標(biāo)準(zhǔn)。本研究中對(duì)3個(gè)批次細(xì)胞樣品進(jìn)行分析，TNF-α刺激的3T3-L1脂肪細(xì)胞胰島素抵抗模型中有或無胰島素刺激時(shí)，GLUT4在細(xì)胞膜上的表達(dá)均明顯下降，說明GLUT4的下調(diào)作用可能與胰島素抵抗相關(guān)。與此同時(shí)實(shí)驗(yàn)中采用了高內(nèi)涵篩選的方法定性定量地進(jìn)行GLUT4膜轉(zhuǎn)位檢測(cè)。

高內(nèi)涵篩選分析作為系統(tǒng)生物學(xué)時(shí)代的一項(xiàng)領(lǐng)先技術(shù)，能夠快速高效獲得細(xì)胞所產(chǎn)生的實(shí)時(shí)和多維立體的生物效應(yīng)信息[30]。在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的前提下，高內(nèi)涵篩選設(shè)備具有的高分辨率熒光數(shù)碼成像系統(tǒng)可以通過多維立體的方式進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控某待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)信號(hào)，可以在實(shí)驗(yàn)中同步檢測(cè)被篩樣品對(duì)于細(xì)胞生理狀態(tài)（如細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)分化狀態(tài)、信號(hào)通路以及細(xì)胞代謝途徑的各個(gè)環(huán)節(jié)）的改變[31]，并且可以從多角度觀察被篩樣品對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)及轉(zhuǎn)移的影響[32]。穆蕊等[33]應(yīng)用HCS平臺(tái)對(duì)TNF-α刺激前后的核因子-κB（NF-κB）的熒光信號(hào)進(jìn)行量化,通過計(jì)算細(xì)胞核/細(xì)胞漿熒光強(qiáng)度的比值來表示NF-κB的細(xì)胞定位。本實(shí)驗(yàn)通過高內(nèi)涵篩選探究了胰島素抵抗模型細(xì)胞中GLUT4分布，結(jié)果顯示TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗可以明顯減少GLUT4的膜轉(zhuǎn)位，在證明胰島素抵抗模型成立的同時(shí)，也可以更加形象直觀地觀察到GLUT4蛋白的分布變化情況。既然脂肪細(xì)胞中GLUT4與胰島素抵抗直接相關(guān)，那么通過高內(nèi)涵定量分析的方法考察GLUT4的膜轉(zhuǎn)位就有可能為驗(yàn)證脂肪細(xì)胞胰島素抵抗提供借鑒。幾次造模結(jié)果均顯示TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型中GLUT4膜蛋白表達(dá)顯著減少，與葡萄糖攝取結(jié)果保持一致。鑒于胰島素抵抗模型成立的鑒定方法多采用檢測(cè)葡萄糖消耗量這一種形式[16-18]，因而本實(shí)驗(yàn)建立起來的GLUT4膜蛋白表達(dá)及膜轉(zhuǎn)位測(cè)定可以作為鑒定模型是否成功及是否穩(wěn)定的指標(biāo)。

綜上所述，本研究運(yùn)用TNF-α孵育3T3-L1細(xì)胞建立胰島素抵抗模型，并且建立起模型鑒定的新指標(biāo)，可進(jìn)一步用于研究炎癥引起的胰島素抵抗機(jī)制及篩選具有抗糖尿病活性的藥物。