血清miRNA-125b與miRNA-21聯合檢測對前列腺癌的診斷價值

余艷玲

(崇州市人民醫院檢驗科，四川 崇州 611230)

前列腺癌是男性常見惡性腫瘤之一，其發病率和死亡率都呈明顯上升趨勢[1]。前列腺癌早期沒有明顯臨床癥狀，當累及膀胱出現膀胱刺激征或尿道梗阻時多數已至中晚期，失去了最佳的治療時機。據國外一項多中心、大標本量的調查顯示，前列腺癌的早期診斷對患者療效和預后有積極意義，提升前列腺癌診斷效率已經成為國內外學者關注的重點[2]。隨著生物醫學技術的不斷發展，更多高效、無創的檢查手段被應用于惡性腫瘤診斷、預后判斷，微小RNA(miRNA)血清學檢測被認為可能是腫瘤診斷的新方向[3]。筆者選擇前列腺癌患者為研究對象，聯合檢測患者血清miRNA-125b與miRNA-21水平，探討其對前列腺癌的診斷價值，以期為前列腺癌臨床診斷提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料選擇崇州市人民醫院2014年1月至2016年1月收治的65例前列腺癌患者為研究對象，年齡范圍為39～72歲，<60歲者為27例，≥60歲者為38例；Gleason評分：≤7分為40例，>7為25例；病理分期：T1～2期患者37例，T3～4期患者28例；前列腺抗原(PSA)：<10 μg·L-1者為17例，≥10 μg·L-1者為48例； 20例發生遠處轉移，45例未發生遠處轉移。納入標準：①患者經過影像學、實驗室及病理檢查，診斷明確；②患者具備完整的病例資料；③收集標本前患者均未進行任何放療、化療或其他生物學治療；④患者一般情況可，無惡病質發生。另選擇我院同期收治的良性前列腺增生患者65例(年齡范圍為35～68歲)、男性健康體檢者65例(年齡范圍為35～70歲)為對照。前列腺癌患者、良性前列腺增生患者、健康體檢者在年齡(χ2=1.329，P=0.475)等一般資料比較中差異無統計學意義，具有可比性。所有納入研究者均知曉本研究目的、過程和意義，簽署知情同意書，本研究得到崇州市人民醫院倫理委員會支持。

1.2主要試劑與儀器低溫高速離心機(Thermo公司，美國)，血清總RNA提取試劑盒(碧云天，中國)，熒光定量PCR試劑盒(碧云天，中國)，ABI-7300熒光定量PCR儀(ABI公司，美國)，引物設計與合成(上海生工)。

1.3方法在患者入院后次日清晨取空腹靜脈血清5 mL，促凝，靜置30 min，4 ℃、3 500 r·min-1離心5 min，取血清于1.5 mL離心管、-80 ℃冰箱保存待測。嚴格按照試劑盒說明書提取血清總RNA，260/280吸光度在1.8～2.2之間為合格標本，可進行逆轉錄合成cDNA。逆轉錄反應體系：1 μg RNA，dNTP(5×RT)1.0 μL，RNA酶抑制劑(40 U·μL-1)0.5 μL，逆轉錄酶(200 U·μL-1)0.2 μL，余以雙蒸水補足至20 μL，逆轉錄條件：16 ℃ 35 min，42 ℃ 35 min，75 ℃ 10 min。完成cDNA后，以定量熒光PCR儀、熒光定量PCR試劑盒，來擴增目的基因，U6為內參基因，miRNA-125b、miRNA-21、U6引物序列見表1，反應體系：cDNA產物1.0 μL，qPCR Mix10 μL(2×miRNA)，Forward primer、Reverse primer各 0.4 μL，余用dd水補齊至20 μL，擴增條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、60 ℃ 320 s、72 ℃ 30 s，共40個循環，均設立3個復孔。根據RT-qPCR曲線得到Ct值，表示熒光達到閾值的循環數，血清miRNA含量采用相對表達量2-△△Ct表示[4]。

1.4統計學方法以SPSS 19.0軟件統計包進行統計學分析，首先對數據進行正態性分布檢測，顯示miRNA含量2-△△Ct非正態分布，故以M(P25,P75)描述，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗；不同病理特征血清miRNA量的差異采用MannWhitneyU檢驗；采用受試者工作特征曲線(ROC)分析miRNA對前列腺癌診斷價值；前列腺癌患者、良性前列腺增生患者、健康體檢者間年齡比較采用Kruskal-Wallis檢驗；所有結果均以P<0.05為差異有統計學意義。

表1 引物序列

2 結果

2.1三組血清miRNA-125b與miRNA-21比較前列腺癌患者血清miRNA-125b表達量為0.885(0.378，1.037)，顯著高于前列腺增生患者的0.332(0.121，0.625)(Z=3.891，P=0.008)，及健康體檢者的0.292(0.108，0.558)(Z=4.023，P=0.005)，前列腺增生患者與健康體檢者間差異無統計學意義(Z=1.342，P=0.379)。前列腺癌患者血清miRNA-21表達量為2.015(1.285，2.572)，顯著高于前列腺增生患者的1.212(0.936，1.763)(Z=3.297，P=0.016)，及健康體檢者的1.378(1.002，1.956)(Z=3.081，P=0.019)，前列腺增生患者與健康體檢者間差異無統計學意義(Z=1.365，P=0.348)。見圖1。

圖1 三組血清miRNA-125b與miRNA-21比較

2.2不同病理特征血清miRNA量的差異血清miRNA-125b在年齡>60歲、Gleason評分>7分、PSA≥10 μg·L-1、T3～4期、遠處轉移患者顯著高表達(P<0.05)。血清miRNA-21在Gleason評分>7分、PSA≥10 μg·L-1、T3～4期患者顯著高表達(P<0.05)，與年齡、是否存在遠處轉移無明顯關系(P>0.05)，見表2。

2.3血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌的診斷效率血清miRNA-125b診斷前列腺癌ROC曲線下面積(AUC)為0.799(95%CI：0.650～0.949)(P=0.001)，miRNA-21的AUC為0.733(95%CI：0.588～0.879)(P=0.009)，而miRNA-125b聯合miRNA-21診斷前列腺癌AUC為0.904(95%CI：0.798～0.982)(P=0.000)。見圖2。

圖2 血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌的診斷效率

3 討論

miRNA是長度約為20～22個核苷酸，進化高度保守，在真核細胞廣泛存在的單鏈小分子RNA，其不具有編碼作用，但是可以通過誘導RNA降解或抑制RNA翻譯、表達來調控細胞分化、增殖、凋亡等生物學行為[5-6]。隨著人類基因圖譜的不斷完善，發現超過50%的miRNA位點在腫瘤相關區域內，提示miRNA表達失衡可能是惡性腫瘤發生的重要原因之一[7]，相關研究也證實，在多種惡性腫瘤組織內有miRNA失衡表達[8]。miRNA可能通過促進腫瘤細胞增殖、分化，抑制凋亡等方式參與腫瘤發生與進展的調控[9]。既往的研究認為miRNA只是在惡性腫瘤組織異常表達，但是隨著研究的深入，發現在外周循環血也存在miRNA失衡表達[10]。血清miRNA在循環血中穩定性高，輕易不被降解，大部分來自腫瘤組織或破裂腫瘤細胞，對腫瘤診斷、分期及預后判斷有一定提示作用，被認為可能是腫瘤無創診斷的新方向[3]。miRNA在前列腺癌發病過程中的作用機制十分復雜，miRNA-32、miRNA-221、miRNA-222在前列腺癌高表達[10]，發揮“促癌”作用，而miRNA-145、miRNA-205在前列腺癌低表達，發揮“抑癌”作用[11]。Selth等[12]對前列腺癌患者血清miRNA進行分析，發現miRNA-141、miRNA-298、miRNA-375等顯著高表達，提示血清miRNA檢測可以作為前列腺癌潛在的診斷指標。

miRNA-125b、miRNA-21作為常見癌基因，在肺癌、肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中都存在異常表達[13]，將二者聯合應用于前列腺癌的診斷還鮮見報道。本研究選擇miRNA-125b、miRNA-21為研究靶基因，發現在前列腺癌患者外周循環血清中異常高表達，而良性前列腺增生患者和健康體檢者間差異無統計學意義，提示miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌發病過程中可能扮演“促癌”作用。miRNA-125b是miRNA家族較為活躍的成員，尤其在惡性腫瘤發病研究較為深入，可以促進腫瘤細胞侵襲、轉移，對腫瘤進展起著十分重要的調控作用。miRNA-125b可以上調前列腺癌細胞雄激素非依賴性生長，并且可能通過干預BBC3、P53等抑癌基因表達來干預腫瘤細胞凋亡程序的啟動。Amir等[14]通過體外實驗證實，在LNCaP、PC-346C、22Rv1三種前列腺癌細胞株中miRNA-125b顯著高表達，并且可以通過調控致癌基因p14(ARF)/Mdm2信號通路及P53 凋亡通路來促進前列腺癌細胞增殖。激素依賴的雄激素受體(AR)與前列腺癌發生關系密切，而miRNA-21可能與AR相關聯。Kotb等[15]通過對前列腺癌患者miRNA矩陣篩選，發現miRNA-21是雄激素誘導的miRNA之一。高水平miRNA-21不但可以促進腫瘤細胞生長和腫瘤形成，而且還可能誘導去勢治療后非雄激素依賴表型出現，導致去勢后發生拮抗現象[16]。

表2 不同病理特征血清miRNA量的差異/M(P25，P75)

我們的研究結果顯示miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌患者血清中都呈高表達現象，這也與其在前列腺癌組織表達情況相符合。Ribas等[17]通過對前列腺癌手術切除組織進行miRNA-21表達量的檢測，發現與癌旁組織相比較其上調幅度超過3倍。本研究對miRNA-125b、miRNA-21與前列腺癌患者病理特征關系進行分析，miRNA-125b與年齡、Gleason評分、PSA濃度、T分期、遠處轉移都有一定關系，而miRNA-21僅與Gleason評分、PSA濃度、T分期相關，這可能是因為miRNA-125b較之于miRNA-21對腫瘤細胞侵襲、轉移的生物學活性有更強的調控作用。血清miRNA-125b、miRNA-21對前列腺癌均有診斷價值，miRNA-125b診斷前列腺癌AUC為0.799，miRNA-21為0.733，但是二者聯合應用AUC可以達到0.904，提示血清miRNA-125b、miRNA-21聯合檢測可以提高前列腺癌的診斷效率。

綜上所述，血清miRNA-125b、miRNA-21在前列腺癌患者高表達，與患者病理特征有一定關系，二者對前列腺癌均有一定診斷價值，但是聯合應用可以提高其診斷效率。