HPLC法測(cè)定蒙藥嘎日迪-5丸中沒食子酸的含量△

安 明 趙國君 方 鑫 鄔國棟*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014060；2.包頭市第四醫(yī)院， 內(nèi)蒙古 包頭 014030)

嘎日迪-5丸為蒙醫(yī)藥最常用的傳統(tǒng)方之一。是由草烏(制)、訶子、木香、麝香、石菖蒲等5味藥制成的蒙藥制劑。具消“黏”，消腫，燥“協(xié)日烏素”等功效，對(duì)蘊(yùn)熱，風(fēng)濕，“黏”性刺痛，白喉，炭疽，寄生蟲病，壞血病，疥廯等有很好療效。該制劑已獲內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文號(hào)(內(nèi)藥制字M14020120)。嘎日迪-5丸方中的訶子有抗氧化、抗菌、抗病毒等功效，其主要活性物質(zhì)為沒食子酸。本實(shí)驗(yàn)在原有基礎(chǔ)上，參考2015版《中國藥典》《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》中訶子的方法、條件等相關(guān)記載，建立了測(cè)定沒食子酸的高效液相色譜法[1-4]。此方法操作簡(jiǎn)單，精密度和回收率高，重線性好，結(jié)果符合要求。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(Ultimate 3000系列，包括帶有在線脫氣單元的雙三元梯度 泵；帶有一個(gè)10通閥的柱溫箱；二極管陣列檢測(cè)器。)SartoriusBSA224S-CW電子天平，島津UV-2201紫外分光光度儀。AS2060B超聲波清洗器、AP系列無油隔膜真空泵、過濾裝置。

1.2 試劑 色譜純甲醇、乙腈；純化水；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸和無水乙醇均為分析純，磷酸，三乙胺；薄層層析硅膠G(青島海洋化工有限公司)。

1.3 試藥 沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)110831-201605)、訶子對(duì)照藥材(批號(hào)121015-201605)：購自于中國食品藥品檢定研究院；嘎日迪-5丸供試品3批(批號(hào)：704211、704212、704213)：由內(nèi)蒙古包頭市中蒙醫(yī)院制劑室提供；模擬樣(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C18色譜柱(250mm×4.6mm，5μm；流動(dòng)相為乙腈-0.1%三乙胺的0.1%磷酸溶液(1：99)；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長：273nm；進(jìn)樣量：10μL。理論塔板數(shù)應(yīng)不低于4000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸對(duì)照品40mg,置于100mL容量瓶中，并精密加入50%甲醇溶液至刻度，制成每1mL含400μg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，精密稱取約0.29g，置于碘量瓶中，加50%甲醇溶液50mL，超聲提取40min，放冷，再次稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，再用0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 分別稱取除訶子以外的其他藥材，按照嘎日迪-5處方比例要求混合，研磨為細(xì)粉，按照“3.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品。

2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1～圖3。

結(jié)果表明，在本色譜條件下，供試品溶液中其他成分與沒食子酸的分離度較好，在對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的位置上，沒食子酸的保留時(shí)間為11min。供試品溶液具有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性對(duì)照溶液無干擾，可見此方法專屬性良好。

2.6 提取效率的考察 以50%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，為保證成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取20min、30min、40min、50min不同超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，數(shù)據(jù)見表1。

由表中數(shù)據(jù)可知，超聲處理40min后樣品含量的增加幅度不大，故將提取效率時(shí)間定為40min。

表1 提取效率考察表

2.7 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品貯備溶液5mL于20mL容量瓶中，加50%甲醇溶解，得所需濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取2、4、6、8、10、12μl，注入高效液相色譜儀。測(cè)定沒食子酸的峰面積值，記錄色譜圖，測(cè)定數(shù)據(jù)見表2。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到?jīng)]食子酸的線性回歸方程為：y =55.5085x+0.1195，r=0.99999。標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖4。

結(jié)果表明：沒食子酸在0.1826～1.0956μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)同相應(yīng)峰面積呈良好的線性關(guān)系

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)值表

2.8 精密度試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液2mL放入10mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，搖勻。取10μl，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)6次，其保留時(shí)間穩(wěn)定，其峰面積平均值為39.9835，RSD為0.05%(n=6)，說明其精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法制備一份供試品，取同一份供試品溶液，在0、3、6、9、12h分別進(jìn)樣10ul，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定沒食子酸的色譜峰面積，計(jì)算其RSD值，測(cè)定數(shù)據(jù)見表3。

由表中數(shù)據(jù)可知：供試品溶液在12h之內(nèi)穩(wěn)定。

表3 不同時(shí)間測(cè)定供試品中沒食子酸的峰面積積分值

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)嘎日迪-5(704211)研細(xì)，精密稱定，約0.29g，，按照“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定沒食子酸的峰面積值，計(jì)算得到了各份樣品中沒食子酸的含量，測(cè)定數(shù)據(jù)見表4。色譜圖見圖5。

由表中數(shù)據(jù)可知，嘎日迪-5的重復(fù)性良好。

表4 沒食子酸含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)704211，含量9.8923mg/g)9份，各0.15g，精密測(cè)定，分別置9個(gè)具塞錐形瓶中，分成3組每組3份，每組分別精密加入濃度為0.3652mg/mL(配制為40.22mg*0.908/100mL)的沒食子酸對(duì)照品溶液各2mL、4mL、6mL(約相當(dāng)于供試品含有量的50%、100%、150%)及相應(yīng)50%甲醇溶液各48mL、46mL、44mL，按“2.1”項(xiàng)下的方法操作，測(cè)定每份含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明,本方法具有較好的回收率。

表5 沒食子酸含量重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 樣品的含量測(cè)定

取3個(gè)批號(hào)樣品(批號(hào)為：704211、704212、704213)，每批樣品各2份，分別按照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備，分別精密量取對(duì)照品溶液與供試品溶液，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定，記錄沒食子酸的峰面積，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中沒食子酸的含量，結(jié)果見表6。

表6 樣品中的沒食子酸含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

4 討論

4.1 檢測(cè)波長的選擇 本研究中選擇沒食子酸作為考察指標(biāo)，因此檢測(cè)波長的的選擇至關(guān)重要，《中國藥典》和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道沒食子酸的檢測(cè)波長為271nm和273nm。取沒食子酸對(duì)照品溶液，于紫外可見分光光度儀上，自200nm-700nm做光譜掃描，沒食子酸在波長273nm與218nm處有最大吸收，選用273nm做檢測(cè)波長。在273nm處沒食子酸有較好吸收，基線波動(dòng)小、平穩(wěn)。

4.2 流動(dòng)相的選擇 溶液(1：99)為流動(dòng)相進(jìn)行流動(dòng)相條件的摸索，沒食子酸具有良好的峰形，并且出峰時(shí)間合適，所以將流動(dòng)相定為乙腈-0.1%三乙胺的0.1%磷酸(1：99)。

4.3 理論塔板數(shù)的確定 對(duì)多批供試品測(cè)定結(jié)果表明，沒食子酸的理論塔板數(shù)在4000以上即能達(dá)到與相鄰峰分開，并符合《中國藥典》規(guī)定R>1.5的要求，故本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定理論塔板數(shù)按沒食子酸峰計(jì)不得低于4000。

4.4 提取時(shí)間的考察 以50%甲醇作為提取溶劑進(jìn)行超聲提取，為保證成分提取完全，實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取20min、30min、40min、50min不同超聲提取時(shí)間對(duì)提取效率的影響，由結(jié)果可知超聲40min后含量增長不多，故將超聲時(shí)間定為40min。

5 結(jié)論

蒙藥嘎日迪-5丸中是以草烏、訶子等五味蒙藥組成蒙藥制劑，為了更好地控制本品的質(zhì)量，本研究采用高效液相色譜色譜法，測(cè)定嘎日迪-5丸中沒食子酸的含量，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。并對(duì)含量測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果表明，此方法簡(jiǎn)單便捷、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、重現(xiàn)性好，可用于嘎日迪-5丸的質(zhì)量控制。