NLR、FIB和Pgp1評估結直腸癌預后的價值

（陜西省寶雞市中心醫院 肛腸外科，陜西 寶雞 721008）

結直腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，發病率和病死率呈逐年上升趨勢[1-3]。目前臨床上對結直腸癌患者的預評估主要是TNM分期[4-5]。但是TNM分期無法滿足個體化治療的要求。目前，臨床上正著力研究可以有效評估結直腸癌預后的檢測手段。本研究擬綜合檢測患者中性粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophillymphocyte ratio, NLR）、纖維蛋白原（Fibrinogen,FIB）和P-糖蛋白1（P-glycoprotein 1, Pgp1）在癌組織的表達。以早期發現有轉移或復發風險的結直腸癌患者，從而制定精準有效的治療方案，提高患者的預后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月-2012年5月于陜西省寶雞市中心醫院行結直腸癌根治性切除術的223例患者作為研究對象。納入標準：①原發性結直腸癌且行根治性切除術；②簽署留取病理標本同意書，病理組織保存完整；③由AJCC第7版腫瘤分期指南診斷的Ⅰ期或Ⅱ期的結直腸癌[6]。排除標準：①于本院治療前進行過放化療；②行根治術時合并其他腫瘤。本研究經醫院倫理委員會審核批準。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料 于患者手術前后整理并記錄完整臨床資料，包括發病年齡、性別、腫瘤大小、病理學類型、腫瘤位置、TNM分期、脈管癌栓及淋巴結轉移情況，有無術前腸梗阻、術后并發癥等。

1.2.2 NLR水平的測定 于次日清晨采集所有患者術前外周血，囑患者采血前8 h內不要喝水進食。以患者肘正中靜脈為穿刺點，穿刺部位2次消毒后，抽取5 ml血液于血常規專用紫色真空采血管中，反復顛倒混勻。標記患者姓名、性別、住院號、采血時間、采血用途及采血人姓名等送檢。使用HF-3800血液細胞分析儀（山東海力孚公司）分析患者血液樣本，記錄中性粒細胞計數（Neutrophil, N）、淋巴細胞計數（Lymphocyte, L），計算兩者比值：NLR=N/L。

1.2.3 FIB水平的測定 于次日清晨采集所有患者術前外周血，囑患者采血前8 h內不要喝水進食。以患者肘正中靜脈為穿刺點，穿刺部位2次消毒后，抽取5 ml血液于凝血四項專用藍色真空采血管中，反復顛倒混勻。注意采血時間盡量≤5 min，采血帶不要扎的太緊，以防激活凝血機制。操作過程中避免產生氣泡，以防FIB變性。標記患者姓名、性別、住院號、采血時間、采血用途及采血人姓名等送檢。使用Clauss法分析患者血液樣本，獲得凝血四項報告單，記錄FIB的數值。

1.2.4 腫瘤組織Pgp1表達水平的測定和評分 采用SP法進行免疫組織化學，一抗為兔抗人Pgp1多克隆抗體，二抗為加入生物素標記的羊抗兔工作液。4%中性甲醛固定病理標本，脫水后石蠟包埋。①以4μm厚進行連續切片，常規烤片及二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，PBS沖洗5 min×4次；②3%H2O2室溫避光孵育10 min滅活內源性過氧化氫酶，PBS沖洗5 min×4次；③用檸檬酸抗原修復液進行熱抗原修復；④山羊血清工作液室溫下封閉10 min后棄去工作液勿洗；⑤將兔抗人Pgp1多克隆抗體分別加入同一患者的幾張切片并置于4℃冰箱孵育過夜，次日37℃復溫40 min后PBS沖洗5 min×4次；⑥加入生物素標記的羊抗兔二抗工作液，37℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×4次；⑦二氨基聯苯胺顯色，流水沖洗15 min后蘇木素輕度復染，常規脫水、透明、干燥及封片，最后于光鏡下觀察并拍照。

由1位經驗豐富的病理科醫生觀察所有切片，每張切片隨機觀察10個高倍鏡視野，根據染色結果進行評分：0分為＜5%；1分為≥5%～＜25%；2分為≥25%～＜50%；3分為≥50%～＜75%；4分為≥75%。染色強度評分：不顯色0分；淺黃色1分；棕黃色2分；深棕色3分。每張切片分值=染色細胞數分值×染色強度分值。若每張切片分值＜1分，則判斷免疫組織化學結果陰性（-）；若為1～3分，則為弱陽性（+）；若為4～5分，則為中度陽性（++）；若＞5分，則為強陽性（+++）。定義Pgp1表達中度陽性（++）和強陽性（+++）為高表達，陰性（-）和弱陽性（+）為低表達。

1.3 隨訪及觀察指標

對所有參與研究的223例患者進行為期5年的隨訪，首次隨訪為治療結束1個月后，之后每隔1個月電話隨訪1次。終點事件為：患者自入選時間起于隨訪期間發生不良預后事件，包括患者結直腸癌復發、分期上升及出現其他器官轉移。原始資料參照患者入院記錄、手術記錄及麻醉記錄，并將末次隨訪記錄作為結果，記錄患者發生不良預后的人數并定義為預后不良組，其余患者定義為預后良好組。患者拒絕訪問、中途退出及死于其他與研究無關的原因定義為失訪。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計學軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，計數資料以率（%）表示，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，單因素Cox回歸分析篩選變量，預后影響因素的分析采用多因素Cox回歸模型。繪制ROC曲線，利用Kolmogorov-Smirnov檢驗比較不同指標評估結直腸癌預后的準確性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者一般資料

223例患者腫瘤直徑平均（4.32±0.56）cm；TNM分期Ⅰ期46例，Ⅱ期177例；平均淋巴結轉移10.46個；脈管癌栓陰性169例，陽性54例；腺癌101例，黏液腺癌122例；術前腸梗阻患者89例，無術前腸梗阻患者134例；術后并發癥患者50例，無術后并發癥患者173例；Pgp1高表達149例，低表達74例；高NLR值123例，低NLR值100例；高FIB值98例，低FIB值125例。

2.2 患者隨訪情況

在隨訪結束時，失訪患者共11例，124例患者隨訪結束未發生終點事件，5年生存率為58.49%（124/212）,定義為預后良好組，78例患者出現了終點事件，定義為預后不良組。Kaplan-Meier生存曲線顯示，隨著時間延長，全體患者不良預后增多，在隨訪的第20、40個月產生不良預后的患者增長較為明顯。見圖1。

圖1 患者不良預后生存曲線圖

2.3 影響結直腸癌患者預后的單因素Cox回歸分析

將可能影響疾病預后的因素（年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、病理類型、術前腸梗阻、術后并發癥、腫瘤組織Pgp1表達、NLR及FIB水平）逐個納入Cox比例風險模型中進行單因素分析。結果發現腫瘤部位、TNM分期對疾病預后無影響（P＞0.05），患者年齡、性別、病理類型、術前腸梗阻、術后并發癥、Pgp1、NLR、FIB水平對疾病預后影響顯著（P=0.027、0.003、0.035、0.021、0.013、0.025、0.012和 0.005）。

2.4 影響結直腸癌患者預后的多因素Cox回歸分析

篩選單因素Cox回歸差異有統計學意義的因素進行多因素Cox回歸分析（引入水準0.05，剔除水準0.10）。結果顯示：年齡和性別對患者預后的影響不明顯（P＞0.05）；病理類型、術前腸梗阻、術后并發癥、Pgp1、NLR及FIB是結直腸癌預后的獨立影響因素（P＜0.05）。見附表。

2.5 Pgp1的結直腸癌預后分析

將Pgp1表達作為結直腸癌術后預后的指標，Pgp1在結直腸癌患者預后的敏感性和特異性分別為60.23%（53/88）和 70.16%（87/124）。

2.6 NLR和FIB單獨及聯合診斷對結直腸癌預后轉歸的評估價值分析

NLR診斷結直腸癌預后的AUC為0.801，最佳診斷點為4.15 ng/ml，其敏感性為62%，特異性為92%；FIB的AUC為0.678，低于NLR，最佳診斷點為594.82 ng/ml，其敏感性為36%，特異性為99%。NLR和FIB兩者聯合診斷結直腸癌預后的AUC最高，為0.856，其敏感性為78%，特異性為79%。兩者聯合預測結直腸癌預后的AUC與NLR和FIB比較，差異有統計學意義（Z=4.939和2.591，P=0.000和0.009）。見圖2。

附表 患者不良預后的Cox多因素分析

圖2 NLR和FIB單獨及聯合診斷對結直腸癌預后的ROC曲線

3 討論

結直腸癌在我國的5年生存率為32.8%～61.4%[7-8]。因此其預后的研究一直是近年的熱點。目前臨床上主要通過病理分型、TNM分期等評估預后[9-10]。然而疾病的演變隨著個體及環境的影響愈發復雜，本研究將NLR、FIB水平和癌組織Pgp1的表達進行綜合分析，以提高預測結直腸癌患者預后的準確性。

本研究的5年生存率為58.49%，與KENNEDY等研究結果基本一致[7]。筆者認為可能是由于本研究納入的患者平均年齡高，大部分合并有其他非腫瘤性的慢性疾病，或由于結直腸癌患者本身的危險因素較多，對預后產生了不良影響。目前越來越多的研究提示血液學指標和免疫學指標與腫瘤預后密切相關[11-12]。本研究中病理類型、FIB、NLR、Pgp1、術后并發癥及術前腸梗阻依次為結直腸癌的預后影響因子。血液學指標FIB、NLR和免疫學指標Pgp1會影響結直腸癌患者預后，可能因為：一方面纖維蛋白原FIB升高預示著由纖維蛋白構成的腫瘤細胞骨架被破壞，癌細胞發生了浸潤與轉移，與大部分發生癌癥轉移的患者體內凝血系統異常相符[13]。NLR升高標志著腫瘤增殖旺盛但體內免疫防衛機制處于被抑制的狀態，預示著預后較差[14]。另一方面，近年來，一些免疫學指標細胞膜跨膜糖蛋白Pgp1可主動泵出對正常細胞來說的異物[15-16]。當其高表達時，可限制癌細胞浸潤和轉移，提示患者預后良好。

為進一步探究NLR、FIB和Pgp1對結直腸癌患者預后的影響，患者對其進行ROC曲線分析。結果顯示，聯合NLR和FIB評估患者預后的敏感性可達78%，較3者單獨預測時均有提高。可能是因為NLR和FIB分別從機體免疫狀態與凝血功能水平方面客觀反映腫瘤細胞的增殖轉移情況，并且雙指標的聯合評估在一定程度上減少了血清、組織及機體反應等方面個體差異對預測結果的影響，提高了預測準確性。

本研究納入的樣本量較少，且Pgp1為定性指標，相比計量指標其準確性有所偏差。建議將來的研究者選擇更多計量資料進行分析，并分別定義年輕患者和老年患者群體各項危險因素指標的臨界值，以提高其預后的準確性。

綜上所述，本研究表明Pgp1、NLR及FIB是影響結直腸癌患者預后的獨立危險因素，NLR和FIB聯合檢測可提高預后的特異性，協助臨床篩選具有預后不良風險的患者，從而制定高效的治療方案。