三七皂苷R1對胺碘酮誘導成纖維細胞氧化應激的干預作用

涂夢蕓，王志翊，萬新龍，翁杰，謝夢影，鄭曉群

（1.溫州醫科大學附屬第二醫院 檢驗科，浙江 溫州 325027；2.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院 檢驗醫學教育部重點實驗室，浙江 溫州 325035；3.溫州醫科大學附屬第二醫院 全科醫學科，浙江 溫州 325027；4.溫州醫科大學 健康與環境生態研究所，浙江 溫州 325035；5.溫州醫科大學附屬第一醫院 呼吸科，浙江 溫州 325015）

胺碘酮是一種含碘苯丙呋喃衍生物，作為III類抗心律失常藥物廣泛應用于臨床[1]。然而，胺碘酮的使用受到其不良反應的限制[2]。大多數不良反應都是小且可逆的，最嚴重的毒性是潛在致命的胺碘酮誘導的肺部毒性（amiodarone-induced pulmonary toxicity，AIPT）。這種不良反應通常與長期使用胺碘酮相關，高達5%～13%的患者以劑量依賴的方式發生，并導致10%～23%的患者死亡[3]。AIPT的病因尚未完全了解，其可能的機制包括直接細胞損傷、磷脂沉積、氧化應激和炎癥介質釋放等[4]。目前，尋找有效的藥物治療AIPT、阻止胺碘酮對肺的毒性作用是國內外研究的熱點。研究[5-6]表明，三七皂苷R1是中藥三七的主要活性成分，具有活血化瘀、抗氧化、抑制細胞內Ca2+內流等作用，但其是否具有對抗胺碘酮致細胞氧化應激的作用尚未見報道。本研究采用胺碘酮在體外建立人胚肺成纖維細胞（human embryonic lung fibroblast，HELFs）氧化應激損傷模型，探討不同濃度的三七皂苷R1對該氧化應激損傷的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑：胺碘酮購自法國賽諾菲-圣德拉堡民生制藥有限公司。三七皂苷R1購自北京索萊寶生物科技有限公司。HELFs購自中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫。胎牛血清、DMEM培養基購自美國Gibco公司；CCK8試劑盒購自日本同仁化學研究所；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒均購自南京建成生物公司。

1.1.2 儀器：酶標儀、HEPA CO2恒溫培養箱、1300 SERIES A2生物安全柜均購自美國Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與實驗分組：使用含10% FBS、1%青鏈霉素混合液的DMEM培養基體外培養HELFs，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養箱中培養，通過倒置光學顯微鏡每日觀察HELFs狀態并按時換液。2 d進行一次傳代，取對數生長期細胞進行實驗[7]。實驗分組：對照組、胺碘酮組、三七皂苷R1干預組和三七皂苷R1對照組。對照組為單純細胞培養；胺碘酮組為在對照組基礎上加入6 μg/mL胺碘酮；三七皂苷R1干預組為在胺碘酮組基礎上，分別加入三七皂苷R1（25、50、100 μg/mL）干預；三七皂苷R1對照組為在對照組基礎上加入100 μg/mL三七皂苷R1。以上各組細胞培養24 h后，觀察各組細胞形態、細胞增殖以及細胞內ROS、MDA和SOD水平的改變。

1.2.2 細胞形態觀察與細胞增殖檢測：采用倒置顯微鏡觀察各組細胞形態變化，用CCK8法檢測各組細胞增殖情況。HELFs以1×104/孔接種于96孔板，每組設6個平行孔。按照1.2.1分組方法進行分組，藥物作用24 h后，吸去培養液，各孔加入無血清DMEM培養基100 μL和CCK8試劑10 μL，同時設置不含細胞的空白對照組，在避光條件下繼續培養3～4 h，通過酶標儀于450 nm處測定各孔吸光度。

1.2.3 ROS含量檢測：按照1∶1 000的比例用無血清DMEM培養液稀釋DCFH-DA，使其終濃度為10 μmol/L。稀釋好的探針DCFH-DA加入各組細胞中，37 ℃避光孵育20 min。用無血清DMEM培養液洗滌細胞3次，使用熒光顯微鏡拍攝熒光圖片，并使用熒光酶標儀，在488 nm激發波長、525 nm發射波長下檢測各組細胞內的熒光強度。

1.2.4 酶化學法測定SOD和MDA水平：細胞分組處理完畢后，胰酶消化并收集細胞，用冷PBS清洗細胞2次，將細胞懸浮于500 μL PBS中，超聲波裂解細胞，4 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度。按照試劑盒說明書檢測SOD活性和MDA含量。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS18.0統計軟件進行統計學處理。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞形態變化 對照組細胞呈較寬大的紡錘形，胺碘酮組細胞明顯變細變長，呈扁平狹長的梭形，三七皂苷R1干預組及三七皂苷R1對照組細胞形態和對照組細胞形態相似，見圖1。

2.2 各組細胞的增殖活性 與對照組相比，胺碘酮組OD值明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.001）。與胺碘酮組相比，25、50、100 μg/mL三七皂苷R1干預組OD值下降，其中100 μg/mL三七皂苷R1干預組下降最明顯，差異均有統計學意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對照組與對照組相比，OD值差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 各組細胞的ROS水平 熒光顯微鏡結果示，胺碘酮組熒光強度明顯增強；與胺碘酮組相比，25 μg/mL三七皂苷R1干預后熒光強度無明顯改變，而50、100 μg/mL三七皂苷R1干預后ROS熒光強度明顯下降，見圖2。熒光酶標儀結果示，與對照組相比，胺碘酮組細胞內ROS熒光強度顯著增加，差異具有統計學意義（P＜0.01）；50、100 μg/mL三七皂苷R1干預后可以使ROS熒光強度下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對照組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

圖1 光學顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化（×200）

表1 各組細胞增殖活性比較（每組n=3，

表1 各組細胞增殖活性比較（每組n=3，

與對照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 OD值對照組 0.77±0.10胺碘酮組 1.35±0.04a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預組 1.03±0.04b三七皂苷R1（50 μg/mL）干預組 0.95±0.08b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預組 0.85±0.08b三七皂苷R1對照組 0.79±0.05

2.4 各組細胞的MDA含量、SOD活性 與對照組相比，胺碘酮作用后HELFs中MDA含量顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.01）；SOD生成顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）。與胺碘酮組相比，50、100 μg/mL三七皂苷R1干預后能顯著調節過氧化物酶表達，其中MDA濃度降低，而SOD活性增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。三七皂苷R1對照組與對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

3 討論

長期使用胺碘酮會導致一些不良反應的發生，其中AIPT可能發展成不可逆轉的肺纖維化因而引起人們廣泛關注[8-9]。動物研究表明，肺中氧化應激的增強是AIPT發展過程中的重要環節，且使用抗氧化劑可以減緩AIPT的進程[10]。三七總皂苷是中藥三七的主要有效成分，而三七皂苷R1是三七總皂苷的主要活性單位。三七皂苷R1主要作用包括減輕炎癥反應、抑制氧化應激和防治缺血再灌注損傷[11-12]。

圖2 熒光顯微鏡下觀察細胞ROS水平（×200）

表2 各組細胞ROS水平比較（每組n=3，

表2 各組細胞ROS水平比較（每組n=3，

與對照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 熒光強度對照組 3 691±309胺碘酮組 6 320±528a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預組 5 982±360三七皂苷R1（50 μg/mL）干預組 4 498±407b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預組 4 293±366b三七皂苷R1對照組 3 413±453

表3 各組細胞內SOD活性和MDA含量比較（每組n=3，

表3 各組細胞內SOD活性和MDA含量比較（每組n=3，

與對照組比：aP＜0.01；與胺碘酮組比：bP＜0.05

組別 SOD（U/mg prot）MDA（nmoL/mg prot）對照組 24.31±1.67 1.35±0.17胺碘酮組 13.51±1.26a 3.82±0.36a三七皂苷R1（25 μg/mL）干預組 16.94±0.91 3.00±0.27三七皂苷R1（50 μg/mL）干預組 19.93±1.11b 2.60±0.19b三七皂苷R1（100 μg/mL）干預組 21.76±1.47b 2.05±0.26b三七皂苷R1對照組 21.77±1.49 1.14±0.10

AIPT的主要病理學改變表現為早期彌漫性肺泡炎和后期成纖維細胞的病理性增殖[13]。本研究采用CCK8法測定細胞增殖活性，結果顯示，胺碘酮作用后，HELF細胞增殖活性明顯升高，表明胺碘酮能夠促進HELF細胞增殖。而在三七皂苷R1干預后，HELF細胞的增殖活性顯著降低，且具有濃度依賴性。三七皂苷R1對照組和對照組細胞的增殖活性不具有統計學差異，表明三七皂苷R1本身對HELFs的增殖活性沒有影響。以上結果提示三七皂苷R1可能通過抑制HELFs的增殖從而延緩AIPT的進展。

氧化應激與肺纖維化的發病機制密切相關，在肺纖維化的形成和發展過程中發揮重要作用。研究發現抗氧化治療能減輕肺纖維化的程度[14-15]。在正常生理狀態下，細胞內ROS的產生和清除處于一種動態平衡狀態。當產生的ROS超出抗氧化劑清除能力時，細胞內氧化還原狀態趨向氧化，從而導致細胞功能發生障礙[16]。本研究結果表明胺碘酮作用后，細胞內ROS水平顯著上升，而在50、100 μg/mL三七皂苷R1干預后，細胞內ROS水平下降。這表明三七皂苷R1一定程度上能夠清除氧自由基，保護細胞免受氧化應激損傷。脂代謝異常可能參與肺纖維化疾病的發病過程[17]。有研究報道，胺碘酮作用于細胞后所產生的氧自由基能夠攻擊生物膜上的多不飽和脂肪酸，引發脂質過氧化，進而導致細胞損傷[18]。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，其含量可以反映機體內脂質過氧化的程度和膜系統受損程度。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能清除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，其活性可間接反映機體清除氧自由基的能力。本研究結果表明，胺碘酮作用于HELFs后，勻漿液中SOD活性明顯下降，而MDA含量明顯升高，這提示胺碘酮能夠引起HELFs氧化損傷。而三七皂苷R1干預后SOD活性升高，MDA含量降低，這提示三七皂苷R1干預后HELFs的抗氧化能力增強、脂質過氧化作用減弱，從而減輕胺碘酮誘導的HELFs損傷。

本研究結果顯示，胺碘酮能夠誘導HELFs增殖能力增強，并發生脂質過氧化，進而對細胞造成一定的損傷。抗氧化劑的應用可以減輕胺碘酮引起的HELFs氧化應激反應[19-20]。在本研究中，三七皂苷R1能明顯減輕胺碘酮誘導的HELFs氧化損傷，調節細胞內過氧化物酶的表達，這為臨床上治療AIPT提供理論基礎，而這一作用的具體分子機制尚需進一步研究。