藍(lán)莓Vc ACS基因的克隆與表達(dá)分析

陳秋紅 韋鵬飛 喻泱華 譚攀 郭崇炎 王志龍

摘 要：1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因（ACS）編碼的蛋白是控制植物體內(nèi)乙烯合成的關(guān)鍵限速酶，在植物發(fā)育、果實(shí)成熟、性別決定及抗逆境等過(guò)程中都發(fā)揮著重要調(diào)控作用。該研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)首次從高叢藍(lán)莓中獲得了ACS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。該基因的cDNA序列全長(zhǎng)為1747bp，其開放閱讀框長(zhǎng)為1323bp，編碼440個(gè)氨基酸，命名為Vc ACS。Vc ACS為親水性蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，含有AAT_like-吡哆醛-5-磷酸保守結(jié)構(gòu)域。進(jìn)化樹分析表明，藍(lán)莓Vc ACS蛋白和中華獼猴桃ACS蛋白的親緣關(guān)系最近。轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果表明，VcACS基因主要在花托、花瓣、雄蕊和根中表達(dá)，在花托中表達(dá)量最高，在嫩莖有低水平的表達(dá)，在葉中不表達(dá)。PEG6000（干旱）、低溫和乙烯利都能誘導(dǎo)Vc ACS基因的表達(dá)上調(diào)，但表達(dá)水平存在差異。該研究成果為藍(lán)莓ACS基因的進(jìn)一步利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；ACS基因；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S663.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2018）21-0010-07

Cloning and Expression Analysis of Vc ACS Gene from Blueberry

Chen Qiuhong et al.

（College of Agricultural，Hunan Agriculture University，Changsha 410128，China）

Abstract：The protein，1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase gene （ACS）is a key rate-limiting enzyme for controlling ethylene synthesis in plants.It plays an important role in plant development，fruit ripening，sex determination and stress resistance.In this research，the full-length cDNA sequence of ACS gene was obtained from highbush blueberry for the first time using RT-PCR and RACE technology.The full-length cDNA sequence of the gene was 1747bp，and its open reading frame was 1323bp，encodes 440 amino acids，named Vc ACS.Vc ACS is a hydrophilic protein with no transmembrane domain.It is predicted to be located in the nucleus or cytoplasm and contains the conserved domain of AAT_like-pyridoxal-5-phosphate.Phylogenetic tree analysis showed that the kinship between Vc ACS protein and ACS protein of Actinidia chinensis was the closest.The results of transcriptional expression analysis showed that Vc ACS gene was mainly expressed in receptacles，petals，stamens and roots，with the highest expression in receptacles and low expression in tender stems，but was not expressed in leaves.PEG6000 （drought），low temperature or ethephon treatment all could induce the expression of Vc ACS gene，but the expression level and induction speed were different.This research lays the foundation for the further utilization of the ACS in blueberry.

Key words：Blueberry；ACS gene；Bioinformatics analysis；Expression analysis

乙烯（ethylene）是一種重要的植物內(nèi)源性氣體激素，參與調(diào)控植物種子的萌發(fā)、性別分化、果實(shí)成熟、生物和非生物脅迫等多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[1-4]。乙烯的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，首先蛋氨酸由腺苷蛋氨酸合成酶催化生成腺苷蛋氨酸，之后腺苷蛋氨酸再由ACC合成酶（l-aminocyclopropane-1-carboxlic acid synthase，ACS）催化生成 ACC（l-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），最后ACC在ACC氧化酶（l-aminocyclo Pro Pane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）的作用下生成乙烯[5，6]。由此可知，在乙烯生物合成途徑中，ACS是一個(gè)關(guān)鍵的限速酶。ACS的合成是受到ACS基因編碼的，但ACS在一般植物組織中含量低，而受生物、非生物脅迫因子誘導(dǎo)進(jìn)行從頭合成，且不易被分離純化[7]。植物中編碼ACS的基因大多是家族基因。目前，研究者已從部分植物中克隆了ACS基因，如在番茄中克隆了9種ACS基因，在擬南芥中克隆了12種，在水稻種分離了5種等等[8]。植物中，不同的ACS基因在植物發(fā)育的不同階段、抗各類生物脅迫、非生物脅迫等具有不同作用。

目前，研究者在很多植物中不僅分離到了ACS基因，并對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)功能研究。在天竺葵克隆的4個(gè)ACS基因中，pGAC-1G在莖、葉、花蕾、花瓣、雌蕊中大量表達(dá)，但在根中幾乎檢測(cè)不到；且ABA能強(qiáng)烈誘導(dǎo)pGAC-1G在葉中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。pGAC-2G在根中表達(dá)量較豐富，在葉和雌蕊中呈中等表達(dá)強(qiáng)度，在莖和花蕾中表達(dá)量較低，在花瓣中幾乎檢測(cè)不到；在葉片中，pGAC-2G對(duì)黑暗處理具有一定程度的響應(yīng)表達(dá)。Pz ACS3幾乎僅在根中表達(dá)，無(wú)論何種處理，都不能誘導(dǎo)PzACS3在葉中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。Pz ACS4在花蕾中表達(dá)水平較高，在莖、葉和花瓣中表達(dá)水平相對(duì)中等，在雌蕊中表達(dá)量較低，在根中不表達(dá)；無(wú)論是黑暗、ABA、乙烯、TDZ處理或者是對(duì)照未處理組，PzACS4在葉中均呈現(xiàn)組成性表達(dá)模式[9]。番茄的9個(gè)ACS基因中，Le ACS1A、Le ACS2、Le ACS3與Le ACS6 都具有調(diào)控果實(shí)成熟的功能，但是它們的表達(dá)模式并不相同[10]。苧麻Bn ACS1基因在苧麻的根、莖、莖尖、葉片、雌花和雄花中均有表達(dá)，且在根系和雄花中表達(dá)較高；ABA和干旱處理都能誘導(dǎo)Bn ACS1組織表達(dá)水平發(fā)生變化，而高鹽處理后Bn ACS1在根、莖尖和葉片中均不表達(dá)[11]。羅漢果Sg ACS1基因在檢測(cè)的植株各個(gè)部位和各個(gè)發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，在授粉后的雌株花蕾中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是授粉前后雌株的花和取粉前后雄株的芽；銀離子處理后的雌株在授粉后的花蕾和芽中Sg ACS1的相對(duì)表達(dá)量最低[12]。對(duì)黃瓜F2分離群體中的性別表型分析表明，CS-ACS1G基因標(biāo)記與性別決定基因F位點(diǎn)具有100%相關(guān)性，在黃瓜花性別決定上起了關(guān)鍵作用；通過(guò)對(duì)黃瓜基因組DNA的Southern雜交和SCAR標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)CS-ACS1G基因?yàn)榇菩韵岛蛠喆菩韵邓赜衃13，14]。轉(zhuǎn)反義ACS基因的番茄在采后貯藏過(guò)程中的乙烯生成量很低，而且對(duì)番茄果腐病病原菌侵染的抗性顯著提高[15]。把反義ACS基因?qū)敕堰€能顯著減緩番茄果實(shí)的成熟衰老速度；而當(dāng)用乙烯利處理后，果實(shí)就會(huì)成熟變軟，其果實(shí)品質(zhì)與正常果無(wú)異，這種耐貯保鮮性的轉(zhuǎn)基因番茄具有明顯的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[16]。水稻中，Os ACS1和Os ACS2能被稻瘟病菌誘導(dǎo)表達(dá)；二化螟、稻縱卷葉螟和褐飛虱為害都能快速誘導(dǎo)水稻中Os ACS2的表達(dá)[17，18]。

藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum L.）又稱為越橘、藍(lán)漿果，為杜鵑花科（Ericaceae）越桔亞科（Vaeeinioideae）越桔屬（Vaccinium）多年生落葉灌木或常綠灌木，約有450種，一般可分為高叢藍(lán)莓、矮叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓3種類型[19，20]。藍(lán)莓果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，含有花青苷、綠原酸、超氧化物歧化酶及不同維生素等生物活性成分，對(duì)治療癌癥、糖尿病、高血壓等都有益處，被譽(yù)為“漿果之王”[21，22]。目前，人們對(duì)藍(lán)莓基因工程方面的研究多集中在抗逆基因和次生代謝產(chǎn)物相關(guān)基因[23-25]，而對(duì)藍(lán)莓果實(shí)成熟相關(guān)的基因研究很少。為此，本研究通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)，首次獲得了可能與藍(lán)莓果實(shí)成熟相關(guān)的Vc ACS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，對(duì)此序列進(jìn)行了相關(guān)生物信息學(xué)分析，并通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析了該基因的組織表達(dá)特性和脅迫表達(dá)特性，為今后進(jìn)一步深入揭示藍(lán)莓Vc ACS基因在果實(shí)成熟和生物脅迫、非生物脅迫過(guò)程中的作用及果樹育種利用方面的作用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)藍(lán)莓“圓藍(lán)”屬于高叢藍(lán)莓，為5年齡成熟樹苗，移栽自宜春藍(lán)玉農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，種植在本實(shí)驗(yàn)室的果圃里，并經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)獲得藍(lán)莓組培苗。在藍(lán)莓生殖生長(zhǎng)期間，取其不同組織器官，用于檢測(cè)Vc ACS基因的組織表達(dá)特性。選取生長(zhǎng)健壯且長(zhǎng)勢(shì)相近的、已經(jīng)培養(yǎng)了2個(gè)月的“圓藍(lán)”組培苗為實(shí)驗(yàn)材料[26]，經(jīng)不同脅迫處理后，檢測(cè)Vc ACS基因脅迫條件下的表達(dá)特性。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 總RNA抽提采用百泰克通用植物總RNA提取試劑盒（RP3302），反轉(zhuǎn)錄前采用Thermo Scientific公司DNAseI處理總RNA樣，cDNA第一鏈合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Scientific）試劑盒。SYBR? Premix Ex Taq?II （TliRNaseH Plus）和SMARTer? RACE 5′/3′Kit購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。金牌PCR MIX（高保真）、2×TSINGKE Master Mix、DL2000 DNA Marker均購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司。引物合成及基因測(cè)序在生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行。大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1、克隆載體試劑盒pEASY-Blunt Zero Cloing Kit購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司。膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司。質(zhì)粒抽提試劑盒在生工生物工程（上海）股份有限公司購(gòu)買。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 藍(lán)莓Vc ACS基因的克隆 根據(jù)GenBanK中已知的甜橙Cs ACS1（Citrus sinensis，CAB60721.1）、蘋果Md ACS3b（Malus domestica，BAE94691.1）、沙梨Pp ACS2（Pyrus pyrifolia，BAA76388.1）、枇杷Ej ACS（Eriobotrya japonica，ACT54524.2）和龍眼Dl ACS（Dimocarpuslongan，ACM48506.3）蛋白的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物（表1），以藍(lán)莓“圓藍(lán)”莖、葉和盛花期全花的混合cDNA為模板，用金牌PCR MIX（高保真）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增Vc ACS基因的保守區(qū)段。PCR擴(kuò)增條件為：95℃、5min預(yù)變形后，95℃、30s、56℃、30s、72℃、30s，此3步循環(huán)33次，最后72℃延伸5min。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收目的條帶，回收產(chǎn)物與pEASY-Blunt Zero Cloing載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)Trans1-T1，轉(zhuǎn)化后感受態(tài)經(jīng)復(fù)蘇后涂皿。過(guò)夜生長(zhǎng)后挑單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性單克隆搖菌后提質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，驗(yàn)證正確后送測(cè)序，得到藍(lán)莓Vc ACS基因部分保守區(qū)段序列；再以該保守序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3′RACE和5′RACE引物，并擴(kuò)增得到相應(yīng)片段，經(jīng)克隆測(cè)序得到片段序列。最后將所得保守序列、3′RACE序列和5′RACE序列進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)擴(kuò)增Vc ACS基因全長(zhǎng)cDNA序列的引物（表1）。經(jīng)擴(kuò)增、克隆、測(cè)序后，得到藍(lán)莓Vc ACS基因全長(zhǎng)cDNA序列。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 藍(lán)莓Vc ACS蛋白的理化特性、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位結(jié)果分別通過(guò)在線軟件Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）、ProtScale（http：web.expasy.org protscale）、TMHM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、GOR （http：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）、Phyr2 （http：http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/～phyre2/html/page.cgi？id=index）和WOLF PSORT （https：//www.genscript.com/tools/wolf-psort）分析得到；用ClustalX2.0軟件進(jìn)行蛋白氨基酸多序列比對(duì)，用MEGA6.06軟件的鄰近相連法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.3 藍(lán)莓 Vc ACS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析在藍(lán)莓生殖生長(zhǎng)期分別取其根、嫩莖、葉、盛花期花瓣、花托、雄蕊、雌蕊以及藍(lán)莓幼果（花后7d）等組織器官樣品，錫箔紙包好后立即用液氮速凍，存于-80℃冰箱，用于基因組織轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性分析。以“圓藍(lán)”組培苗為實(shí)驗(yàn)材料，分別用20%PEG6000、4℃和2mmol/L乙烯利（ETH）進(jìn)行干旱、低溫和外源乙烯利脅迫處理，并在處理0h、1h、6h、12h和24h時(shí)分別整株取樣，錫箔紙包好后立即用液氮速凍，存于-80℃冰箱，用于基因脅迫轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜分析。分別提取藍(lán)莓不同組織器官及不同脅迫處理后的RNA，合成cDNA第1鏈。根據(jù)藍(lán)莓Vc ACS全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物ACS-qRT-F和ACS-qRT-R，以Vc GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參（引物見表1），檢測(cè)藍(lán)莓Vc ACS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓ACS基因的克隆與序列分析 以藍(lán)莓嫩莖、葉和盛花期全花的混合cDNA為模板，擴(kuò)增得到Vc ACS基因保守區(qū)段條帶（圖1A），經(jīng)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其大小為994bp。用該保守序列設(shè)計(jì)5′RACE引物、3′RACE引物，擴(kuò)增得到5′RACE片段（圖1B）和3′RACE片段（圖1C），經(jīng)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其大小分別為1309bp和727bp。將保守序列、3′RACE序列和5′RACE序列拼接后，獲得Vc ACS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA的引物并擴(kuò)增得到Vc ACS基因的全長(zhǎng)cDNA序列片段（圖1D），經(jīng)克隆測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其大小為1747bp。該序列經(jīng)DNAstar軟件分析和 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù) BLAST 比對(duì)后，確定該基因開放閱讀框長(zhǎng)為1323bp，編碼440個(gè)氨基酸（圖2），命名為Vc ACS。

A.cDNA保守區(qū)段擴(kuò)增 B.5′RACE擴(kuò)增 C.3′RACE擴(kuò)增 D.全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增

2.2 藍(lán)莓Vc ACS蛋白理化性質(zhì)及功能預(yù)測(cè)分析 利用Protparam在線軟件分析Vc ACS蛋白的理化特性，結(jié)果表明，藍(lán)莓VcACS基因所編碼蛋白分子式為C2208H3422N596O673S19，相對(duì)分子質(zhì)量為4.96kD，理論等電點(diǎn)是5.20，脂溶指數(shù)為79.34，總平均親水性值為-0.350。利用ProtScale軟件對(duì)該蛋白氨基酸進(jìn)行疏水性分析，由圖3A結(jié)果可知，其疏水性最大值為1.756（第125位氨基酸位處），最小值為-3.178（第335位氨基酸位處），總體上看該蛋白為親水性蛋白，這與Protparam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果一致。用TMHM軟件分析Vc ACS蛋白是否為跨膜蛋白，結(jié)果見圖3（B），該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域，不是跨膜蛋白。利用NCBI線上的CDD軟件對(duì)Vc ACS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析（圖4）。由圖4可知，該蛋白是1個(gè)典型的1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase蛋白（PLN02607），含有AAT_I超家族特征結(jié)構(gòu)域，屬于Aminotran_1_2蛋白超家族。

使用在線軟件GOR4對(duì)藍(lán)莓Vc ACS蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果見圖5（A），Vc ACS蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含有182個(gè)α-螺旋，71個(gè)延伸鏈和184個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲，它們分別占到蛋白總氨基酸的41.36%、16.82%和41.82%。對(duì)Vc ACS蛋白進(jìn)行相似三級(jí)結(jié)構(gòu)模型建模，結(jié)果見圖5（B），找到與其模型最相近的蛋白，為1-aminocyclopropane-1-carboxylate酶（ACS）。Vc ACS蛋白的415個(gè)氨基酸殘基（占整個(gè)蛋白的94%）與此蛋白模型具有100%的相似度。利用WOLF PSORT預(yù)測(cè)分析該蛋白的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果顯示，藍(lán)莓Vc ACS蛋白可能定位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)。

2.3 藍(lán)莓Vc ACS同源性比較與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 通過(guò)Genbank上的Blastx工具對(duì)Vc ACS蛋白序列進(jìn)行同源性檢索，選取11條同源性較高的植物ACS蛋白序列，即中華獼猴桃Acv ACS（Actinidia chinensisvar.chinensis，PSS01957.1）、毛白楊Pt ACS7（Populustrichocarpa，XP_002308289.1）、蓖麻Rc ACS7（Ricinus communis，XP_002514161.1）、栓皮櫟Qs ACS7（Quercus suber，XP_023898923.1）、白花鶴望蘭Hu ACS7（Herraniaumbratica，XP_021276619.1）、柑橘Cs ACS7（Citrus sinensis，XP_006475545.1）、桃樹Pp ACS7（Prunus persica，XP_020424364.1）、白羽扇豆La ACS4（Lupinusalbus，AAF22108.1）、蔓花生Ad ACS7（Arachisduranensis，XP_015955230.1）、蘋果Md ACS3c（Malus domestica，BAE94692.1）和野桑蠶Mn ACS7（Morusnotabilis，XP_010090013.1），利用ClustalX2.0軟件進(jìn)行序列同源性比對(duì)，結(jié)果見圖6。共比較了448個(gè)氨基酸殘基，保守的氨基酸殘基達(dá)81.47%，有279個(gè)氨基酸殘基在比較的所有物種中完全保守，占62.28%（上標(biāo)“*”），有57個(gè)氨基酸殘基高度保守，占12.72%（上標(biāo)“：”），還有29個(gè)氨基酸殘基較高度保守，占6.47%（上標(biāo)“.”）。

在序列對(duì)比的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步了解藍(lán)莓Vc ACS與其他植物ACS之間的進(jìn)化關(guān)系，用以上12條植物ACS氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖7可知，這些物種的Vc ACS蛋白序列可以聚為以下2大類；在第1大類中，藍(lán)莓和中華獼猴桃的ACS最先聚合，其ACS氨基酸序列相似性達(dá)99%，這說(shuō)明Vc ACS在進(jìn)化上與中華獼猴桃ACS親緣關(guān)系相對(duì)最近；第2大類包括2個(gè)亞類，其中一類包括蓖麻、白花鶴望蘭和毛白楊，另外一類包括栓皮櫟、柑橘、桃樹、白羽扇豆、蔓花生、蘋果和野桑蠶。這說(shuō)明藍(lán)莓Vc ACS在進(jìn)化上與這些物種的ACS親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。

2.4 藍(lán)莓Vc ACS基因表達(dá)分析 采用熒光相對(duì)定量PCR技術(shù)檢測(cè)藍(lán)莓不同組織器官中的Vc ACS基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，結(jié)果見圖8。由圖8可知，VcACS基因在藍(lán)莓的根、嫩莖、花托、花瓣、雌蕊、雄蕊和幼果中表達(dá)，在葉片中不表達(dá)；在花托中表達(dá)量最高，其次是雄蕊和根，在花瓣和雌蕊中表達(dá)量相對(duì)較低，在嫩莖中幾乎不表達(dá)。

對(duì)藍(lán)莓組培苗進(jìn)行不同的脅迫處理后，采用熒光相對(duì)定量PCR技術(shù)檢測(cè)藍(lán)莓Vc ACS基因相對(duì)表達(dá)變化水平，結(jié)果見圖9。由圖9可知，在PEG6000（干旱）處理1h時(shí)，藍(lán)莓Vc ACS基因表達(dá)水平明顯提升，比0h高了5倍左右而達(dá)到最高值；之后Vc ACS表達(dá)量下降，但仍比0h要更高，說(shuō)明干旱能誘導(dǎo)Vc ACS基因的表達(dá)。在4℃低溫處理后，Vc ACS基因受到誘導(dǎo)，其表達(dá)量隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而慢慢升高，并在24h達(dá)到最高值，為0h的7倍左右。乙烯利（ETH）處理藍(lán)莓組培苗后，Vc ACS基因也受到了誘導(dǎo)，其表達(dá)水平隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而漸漸升高，在24h達(dá)到最大值，為0h的2倍左右。

3 討論與小結(jié)

ACS基因是乙烯生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶基因，在許多植物中都已經(jīng)被克隆到，但是目前在藍(lán)莓中還未見報(bào)道。本研究通過(guò)RT-PCR和RACE技術(shù)首次獲得了藍(lán)莓Vc ACS基因的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)此序列編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析后發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于AAT_Ⅰ超家族，含有AAT_like-吡哆醛-5-磷酸保守結(jié)構(gòu)域，具有典型的ACS基因家族結(jié)構(gòu)特征；三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)后也發(fā)現(xiàn)其與1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶的結(jié)構(gòu)最為接近，進(jìn)一步的同源性比較和進(jìn)化樹分析后表明，Vc ACS蛋白與其他物種的ACS蛋白高度同源。這些都說(shuō)明所克隆得到的藍(lán)莓Vc ACS基因是ACS基因家族成員之一。

ACS基因家族中的不同成員在植物的不同生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和不同逆境環(huán)境中起著不同的調(diào)控作用，并具有不同的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。不同的ACS基因在植物不同組織中有的為組成型表達(dá)，有的是特異性表達(dá)。有些ACS基因受到各種逆境誘導(dǎo)表達(dá)[11]。‘云香水仙Nt ACS1基因在花瓣和副冠中的表達(dá)水平都是隨著花的衰老而呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，Nt ACS1基因在花瓣和副冠中的表達(dá)量最高值都在花苞期[27]。文心蘭On ACS2基因在花蕊柱中表達(dá)量最高，其次是花萼、花瓣和葉片，而在根、莖及花唇瓣中的表達(dá)量很少[28]。小蒼蘭中的Fh ACS1基因在花朵不同器官的雄蕊中表達(dá)量最高，花瓣中次之，在雌蕊中最低；在花朵完全開放時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高值，大部分開放時(shí)的表達(dá)量次之，完全衰老花朵中的表達(dá)量最低[29]。本研究中藍(lán)莓Vc ACS基因在花的不同組織中的表達(dá)量高低是：花托>雄蕊>花瓣>雌蕊。這與文心蘭中On ACS2基因和小蒼蘭中Fh ACS1基因表達(dá)情況很相似。前人研究表明，小蒼蘭花芽中檢測(cè)到的95%的ACC均來(lái)自花藥，花是產(chǎn)生乙烯的重要器官[30]。藍(lán)莓Vc ACS表達(dá)量較高的幾個(gè)組織都集中在花上，因而推測(cè)藍(lán)莓的花器官是產(chǎn)生乙烯的重要部位。Vc ACS基因在檢測(cè)的藍(lán)莓大部分組織中都有表達(dá)，但在根、花等非綠色組織中表達(dá)量較高，但嫩莖和幼果等綠色組織中的表達(dá)量較低，在葉片中甚至不表達(dá)，這表明藍(lán)莓Vc ACS基因具有明顯的組織表達(dá)特異性。

前人研究發(fā)現(xiàn)，用乙烯利處理甘蔗幼苗后，甘蔗Sc-ACS1基因在葉中表達(dá)，在根中不表達(dá)；Sc-ACS2在根和葉中都表達(dá)；Sc-ACS3則主要在根表達(dá)，在葉中不表達(dá)；而且Sc-ACS1對(duì)低溫、暗培養(yǎng)、LiCl脅迫和IAA處理都有響應(yīng)[31]。羅漢果Sg ACS3基因在授粉前雌株葉和花芽中的表達(dá)水平較高；在Ag+處理前的雌株的花芽和葉中的相對(duì)表達(dá)量都明顯高于Ag+處理后的雌株中的表達(dá)量[32]。在浸水處理并保持恒定光照和溫度條件下的沼生酸模幼苗檢測(cè)到了RP-ACS1基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而且其表達(dá)水平在處理的前12h相對(duì)較穩(wěn)定，在處理24h后明顯上升[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)莓Vc ACS基因可以受到PGE6000（干旱）、低溫和外源乙烯的誘導(dǎo)表達(dá)，但對(duì)于不同脅迫的誘導(dǎo)時(shí)效和誘導(dǎo)水平具有顯著差異，這表明該基因可能以不同的方式參與了藍(lán)莓應(yīng)對(duì)不同脅迫的反應(yīng)。

本研究克隆得到的Vc ACS基因具有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶基因的典型特征，是藍(lán)莓中分離的第一個(gè)ACS基因。Vc ACS基因是否具有調(diào)控藍(lán)莓果實(shí)發(fā)育及抗逆性等方面的功能還有待進(jìn)一步深入研究。藍(lán)莓Vc ACS的特征闡明和功能分析將有助于其進(jìn)一步的應(yīng)用。

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（責(zé)編：張宏民）