異丙醇法提取超氧化物歧化酶的工藝優化研究

田小海 崔洪艷 王莘

摘 要：目的：探索優化異丙醇法從活性干酵母中提取超氧化物歧化酶的最佳工藝條件。方法：通過L9（34）正交試驗設計，確定異丙醇濃度、攪拌時間、1次丙酮沉淀體積、2次丙酮沉淀體積對超氧化物歧化酶提取效果的影響，并采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶的活性。結果：最佳工藝條件：異丙醇濃度85%、攪拌時間16h、1次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）為0.8、2次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）為0.9，所得酶活性為810.00U/g，比活力為3240.00U/mg。結論：通過試驗研究，改善了現有的異丙醇法從活性干酵母提取超氧化物歧化酶的工藝條件，減少了原料的消耗，節省了時間和能源。

關鍵詞：活性干酵母；超氧化物歧化酶；提取工藝

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）21-0029-03

Study on Optimization of Extraction of Superoxide Dismutase by Isopropanol

Tian Xiaohai et al.

Abstract：Objective：Optimization of the best conditions for extraction of superoxide dismutase from active dried yeast by isopropanol.Method：The effects of isopropanol concentration，stirring time，primary acetone precipitation volume and secondary acetone precipitation volume on the extraction effect of superoxide dismutase were determined by the orthogonal test design of L9（34）.The activity of superoxide dismutase was determined by the autooxidation method of catechol.Result：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.8，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 340.00 U/mg.Conclusion：Best process conditions：85% isopropanol concentration，16 H stirring time，first acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.7，second acetone precipitation volume ratio（acetone：crude extract）of 0.9，the resulting enzyme activity is 810.00U/g，The specific activity is 3240.00 U/mg. Conclusion：The present process of extraction of superoxide dismutase from active dry yeast by isopropanol was improved，which reduced the consumption of raw materials and saved time and energy.

Key words：Active dry yeast；Superoxide dismutase；The extraction process

超氧化物歧化酶又名肝蛋白，能專一地清除生物氧化過程中產生的超氧陰離子自由基并減少和阻止脂質的過氧化反應、延緩機體衰老，在生物體中具有重要功能[1，2]。目前，超氧化物歧化酶的主要來源是從牲畜動物血中提取，其安全性及質量均不穩定，且原料來源受到很大的限制[3]。隨著發酵工業的發展，到了20世紀80年代后期，美國和日本先后利用發酵法生產超氧化物歧化酶，雖然大大降低了生產成本，但也存在著提取工藝復雜的問題。目前國內一些實驗室研究利用酵母菌提取超氧化物歧化酶，酵母菌生產超氧化物歧化酶具有繁殖快、代謝時間短、產率高、易培養、易規模化生產、不受季節與自然條件的限制等優點[4]。根據文獻報道酵母菌是眾多微生物中超氧化物歧化酶含量最多的菌種之一[5]，本研究以酒精活性干酵母為提取原料，并對提取工藝進行優化。

1 方法與流程

1.1 菌種活化、保存與擴大培養 菌種活化（采用葡萄糖水培養基[6]）：取5g葡萄糖置于500mL三角瓶中，加水200mL，溶解后于電爐加熱煮沸，冷卻后于121.3℃，103.4kP滅菌20min。活性干酵母0.4g，35℃條件下加入活化液中，自然冷卻至28℃后，置于28℃恒溫水浴箱中水浴活化4h。斜面保存（采用葡萄糖蛋白胨瓊脂培養基）：按葡萄糖∶蛋白胨∶瓊脂∶酵母膏為8∶2∶2∶1的比例取量后加蒸餾水于121.3℃，103.4kP滅菌20min。取活化后菌種，在無菌工作臺進行斜面接種，培養5d，冷藏保存備用。擴大培養（采用液體培養基[7]）∶按葡萄糖∶蛋白胨∶酵母膏∶磷酸二氫鉀：七水硫酸鎂為20∶5∶5∶2.5∶1的比例取量后加入微量Fe粉，加蒸餾水后于121.3℃，103.4kP滅菌20min。取適量保存菌種，接種后于28℃搖床培養24h后4000r/min離心10min后取濕菌體備用提取超氧化物歧化酶。

1.2 超氧化物歧化酶提取 采用異丙醇破壁，丙酮二次沉淀法。濕菌體與異丙醇（90%）按照1∶9的比例浸泡后抽濾除去有機溶劑，加入3倍體積、pH為7.0的磷酸鹽緩沖溶液，攪拌后4000r/min離心10min，收集上清液即為粗酶液。

1.3 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶純化[8] 利用鹽酸調pH至5.0，按丙酮∶粗酶液體積為1∶1的比例混合搖勻，靜置一段時間后高速離心去除雜蛋白，調節pH至4.0為超氧化物歧化酶等電點，再按照適當的體積比混合丙酮與粗酶液后高速離心10min收集沉淀即可。

1.4 超氧化物歧化酶提取流程 酒精活性干酵母擴大培養→收集發酵液→離心收集菌體→異丙醇浸泡→抽濾去除有機溶劑→磷酸鹽緩沖液攪拌處理→收集上清液→等電點沉淀法除雜蛋白→一次丙酮沉淀→等電點沉淀得超氧化物歧化酶→二次丙酮沉淀。

1.5 超氧化物歧化酶比活力測定方法[9] 活性干酵母超氧化物歧化酶酶活力測定：鄰苯三酚自氧化法（酶活單位定義：在25℃恒溫條件下，1mL反應液中，1min抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%的酶量定義為1個酶活單位）。

2 儀器與材料

2.1 試驗儀器 無菌工作臺、恒溫搖床、TDL-5離心機、多循環水式真空泵、恒溫磁力攪拌器、PHS-3型酸度計、布氏漏斗、抽濾瓶、分光光度計（可見光和紫外光）、高壓蒸汽滅菌箱、電子天平、三角瓶、燒杯、酸堿滴定管、移液管、玻璃棒、試管、接種環

2.2 試驗材料 酒精活性干酵母（市售湖北安琪酵母公司生產）、異丙醇、丙酮、考馬斯亮藍G-250、磷酸緩沖溶液、Tris-HCL緩沖溶液、EDTA、鄰苯三酚、蛋白胨、瓊脂、酵母膏、葡萄糖、Fe粉、蒸餾水。

3 結果與分析

3.1 酒精活性干酵母超氧化物歧化酶提取的正交試驗設計 通過文獻報道與反復實驗，確定提取工藝中的4個主要影響因素，分別是：A：異丙醇濃度；B：攪拌時間；C：1次丙酮濃度（體積比）；D：2次丙酮濃度（體積比），并根據文獻與實驗經驗，進行水平取值，結果見表1，采用L9（34）正交實驗設計方法，進行優化實驗。

3.2 正交試驗結果 通過正交試驗結果分析，各項影響因素最佳水平組合為A2B1C2D2，即異丙醇濃度85%、攪拌時間16h、1次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）0.8、2次丙酮沉淀體積比（丙酮：粗提液）0.9。

3.3 優化提取工藝后試驗結果 L9（34）正交實驗有效地優化了活性干酵母超氧化物歧化酶的提取工藝，為了驗證正交試驗的結果，試驗選取優化后的工藝技術參數進行反復試驗，得出優化提取工藝后的試驗結果見表3。從表3可知，粗提液中酶的比活力、1次丙酮沉淀后酶的比活力、2次丙酮沉淀后酶的比活力呈遞進式增長，充分證明丙酮2次沉淀法純化活性干酵母超氧化物歧化酶的重要作用，且此法生產工藝簡單、成本低，具有一定的推廣研究價值。

4 結論與討論

異丙醇濃度水平取值為80%、85%、90%，實驗證明：有機溶劑濃度為85%時，破壁提取效果最好好，選擇85%。通過對正交實驗結果進行極差分析，發現2次丙酮沉淀體積是最大的影響因素，優化后2次丙酮沉淀體積為0.9，攪拌時間是第2影響因素16h，且16h縮短了工藝流程，利于生產成本的降低，第3影響因素為1次丙酮沉淀體積，1次丙酮沉淀體積不能過高，否則導致過多超氧化物歧化酶隨著雜蛋白沉淀，降低酶提取率，最小的影響因素為異丙醇濃度。

通過大量實驗，證明從活性干酵母中提取SOD的最佳工藝為異丙醇-丙酮2次沉淀法，基本工藝流程與關鍵技術參數如下：A：菌種活化與保存備用（35℃加入活化液，30℃活化4h）；B：液體發酵擴大培養（28℃搖床振蕩培養，150rpm，培養24h）；C：異丙醇法細胞破壁提酶（85%異丙醇，攪拌16h，測定酶活）；D：第1步純化（1次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.8（體積比），測定酶活]；E：第2步純化（2次丙酮沉淀）[丙酮：粗提液=0.9（體積比），測定酶活]。

通過查閱文獻，對從酒精活性干酵母中制備的超氧化物歧化酶酶活性進行比較發現：采用酶裂解法、氯仿-乙醇法、細胞自溶法和石英砂研磨法提取超氧化物歧化酶[10]，酶活性分別為691.7U/g、225.8U/g、706.9U/g和236.67U/g。在此次試驗過程中經過優化的異丙醇-丙酮2次沉淀法酶活性為810.00U/g。因此，試驗中獲得的酶活性較高優于其他4種方法。

參考文獻

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[9]Marklund S，Marklund G.Involvement of the superoxide anionradical in the autoxidation of pyorgallol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].Eur J Biochem，1974，47：469.

（責編：張宏民）