肺結核患者肺組織微生物組特征研究

王宇軒 王沖 董宇杰 杜偉麗 宋婧 劉子臣 李琨 劉樹庫 車南穎

微生物組是指某一特定環境內全部微生物的總和。目前普遍認為，人體內有很多共生微生物菌群，其基因組含量總和是人類基因組總和的100倍，這些菌群無法通過傳統的培養方法進行鑒定，但與人類的健康與疾病息息相關。新一代高通量測序(next generation sequencing，NGS)技術通過對環境中16S rRNA進行測序，幾乎能檢測到環境中所有的微生物，這使特定生物樣品中微生物組的研究成為現實。有研究通過NGS技術表明，肺部存在微生物，證明肺部不是無菌的，并且這些微生物分布特征與肺部的健康與疾病狀態有著一定的關聯[1-3]。已經有研究表明，一些慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺疾病，其疾病的發生發展與肺部微生物的改變有很大關系[4-6]。當前對于肺結核患者的肺部微生物組特征的研究非常有限，已有研究主要使用不同患者的痰或支氣管灌洗液等新鮮標本來研究肺部微生物組，但這些標本的獲取都是通過氣管與支氣管，無法研究同一患者不同部位的微生物組差異，這就難以反映肺部微生物組最真實的分布及變化。目前，從福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed and paraffin-embedded，FFPE)的組織標本中提取DNA的技術已經非常成熟，可以使用測序方法檢測到抗酸桿菌的DNA[7]。FFPE組織標本具有可以長期保存和可重復檢測的優點，這使其能廣泛應用在臨床病理診斷的項目中，如結核分枝桿菌(MTB)的檢測和腫瘤基因突變。筆者采用激光顯微切割技術，按照肺結核病理組織分類將同一患者的FFPE組織切片分為壞死區、肉芽腫區和無病變正常肺區，采用NGS技術對配對樣品進行測序，探索肺部不同病變區和正常區的微生物組特征，以期為臨床診斷提供一定依據。

材料和方法

1.組織標本：選取2016—2017年首都醫科大學附屬北京胸科醫院10例臨床及病理確診為肺結核患者的FFPE手術治療標本。對10例患者的FFPE標本進行切片、撈片、蘇木素-伊紅染色(hematoxyli-neosin staining，HE)，在顯微鏡下觀察并選取典型的結核病灶。壞死區域選取標準：鏡下觀為紅染無結構的顆粒狀物；肉芽腫區域選取標準：鏡下觀為類上皮細胞、郎漢斯巨細胞、淋巴細胞和成纖維細胞；無病變正常肺區域(簡稱“正常肺區”)選取標準：鏡下觀肺泡間隔纖細，肺泡壁上90%以上為Ⅱ型肺泡上皮細胞。

2.顯微切割：使用LEICA RM2135(德國Leica公司)切片機將每個FFPE組織切8～12張4 μm厚的樣品切片至LEICA HI1220(德國Leica公司)攤片機中，撈取置LEICA Membrane Slides(德國Leica公司)專用載玻片上。使用LEICA AUTO STAINER XL(德國Leica公司)全自動染色儀進行HE染色，染色后不封片。將染色后的玻片置于LEICA LMD7000(德國Leica公司)激光顯微切割儀上，根據上述提到的鏡下形態及組織大小，切割所需組織，使用離心管收集組織片。

3.DNA提取：提取通過顯微切割收集的不同區域的組織片中的DNA。在裝有組織片的離心管中加入250 μl DNA裂解液后，放入TIB核酸提純儀[泰普生物科學(中國)有限公司]中并選擇DNA程序30 min。按照TIB DNA-FFPE-RY[泰普生物科學(中國)有限公司]核酸提取試劑說明進行提取。最終，用50 μl洗脫緩沖液將提取到的DNA洗脫至1.5 ml離心管中。

4.PCR擴增及質量控制：使用地球微生物組計劃推薦的16S rRNA V4區域通用引物(515F-GCTCCAGCMGCCGTAA，806R-GGACTACHV-GGGTWTCTAAT)進行PCR，擴增16S rRNA基因。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR擴增試劑盒和PCR儀分別采用2×KAPA HiFi HotStart Ready Mix(美國Kapa Biosystems公司)和BIO-RAD C1000 Touch(美國Bio-Rad公司)。PCR擴增條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，45 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，5個循環；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，10個循環；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，25個循環；72 ℃ 5 min。使用2%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行質量檢測，選出擴增條帶為500 bp左右的樣本，采用AMPure XP Beads(美國Beckman Coulter公司)磁珠純化PCR擴增產物。

5.測序及原始數據處理：采用Illumina HiSeq PE250(美國Illumina公司)測序儀對不同區域的組織DNA進行高通量測序。采用QIIME 1.8.0對原始數據進行過濾、拼接，得到的有效數據做OTU(operational taxonomic units)聚類和物種注釋分析。根據GREENGENE數據庫，對OTU的代表序列做物種注釋，得到對應的物種信息和物種的相對豐度分布情況。應用goods_coverage表示測序深度能否覆蓋樣品中全部微生物；Chao 1指數和Shannon指數表示樣品物種多樣性。

6.統計學分析：使用原始數據，在Rv 3.5軟件中計算出微生物組屬水平的Bray-Curtis距離用于主坐標分析(principal co-ordinates analysis，PCoA)，并利用非參數多元方差分析進行組間差異分析。通過SIMCA-P對物種相對豐度做偏最小二乘法判別分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)得到變量投影重要性(variable important projection，VIP)值，采用SPSS 21.0軟件對物種相對豐度進行配對樣品非參數Wilcoxon秩和檢驗確定組間有差異的菌種，以P<0.05為差異有統計學意義。利用Rv 3.5軟件，將門水平和屬水平的物種信息繪制成韋恩圖。在GraphPad Prism 5軟件中，將不同組織區域的物種相對豐度繪制箱型圖和折線圖。

結 果

1.樣本信息及物種多樣性：10例患者石蠟樣品切片依次按照壞死區、肉芽腫區、正常肺區進行顯微切割，得到30份配對樣本，其中27份測序成功，3份因樣品微生物DNA含量較低而導致測序失敗，最終得到8例患者(24份)完整的配對樣品結果，2例患者(3份)非配對樣品結果。所有樣品的goods_coverage均>99.9%，說明所獲得的高通量序列能覆蓋樣本中幾乎所有的微生物。Chao 1和Shannon指數壞死區分別為359.18±77.88和4.19±0.39；肉芽腫區分別為298.83±40.23和3.73±0.39；正常肺區分別為257.16±48.37和3.59±0.48。將基于屬水平的Bray-Curtis距離的β多樣性結果做PCoA排序分析(圖1)，結果表明除正常肺區樣品外，病灶區域即壞死區和肉芽腫區樣品聚集到一起，說明正常肺區和病灶區的微生物群落組成有差異。

圖中各點距離代表不同樣本間微生物組特征差異，PCoA1為最大解釋數據變化的主坐標成分，PCoA2為解釋余下的變化度中占比例最大的主坐標成分圖1 肺結核患者病理組織石蠟樣品切片不同病理組織分類區域主成分分析

圖2 肺結核患者肺部各區域門水平及屬水平微生物分布韋恩圖

2.門水平微生物組特征：在門水平上，肺部微生物成功注釋到的有30種，其中壞死區27種，肉芽腫區21種，正常肺區23種，3種區域共有的細菌有19種(圖2)。肺結核患者肺部微生物主要含有Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes、TM7和Bacteroidetes(表1)。Adonis分析顯示壞死區與肉芽腫區(F=1.39，P=0.261)，壞死區與正常肺區(F=1.33，P=0.271)，以及肉芽腫區與正常肺區(F=1.118，P=0.323)之間的微生物群落組成差異無統計學意義。基于Bray-Curtis距離的Adonis分析表明，3種不同組織區域的微生物群落組成在門水平上差異無統計學意義。

表1 主要微生物在肺結核患者肺部各區域門水平相對豐度的比較

3.屬水平微生物組特征：本研究的27個樣本在屬水平上共注釋236個屬，其中壞死區有203個，肉芽腫區190個，正常肺區171個，3種區域共有的類群有139個屬(圖2)。基于Bray-Curtis距離的多元方差分析表明，壞死區和肉芽腫區的微生物組差異無統計學意義(F=1.11，P=0.288)，而壞死區和正常肺區(F=3.94，P=0.005)，肉芽腫區和正常肺區(F=4.76，P=0.002)的微生物組差異有統計學意義。總的來說肺結核患者肺部微生物主要含有7個主要屬(相對豐度>1%)，依次為Ochrobactrum、Sphingomonas、Corynebacterium、Brevundimonas、Brevibacterium、Sphingobacterium和Enhydrobacter。在相對豐度<1%的屬中，PLS-DA分析表明Kocuria和Tsukamurella在不同的組織部位差異較大(表2)。

表2 主要微生物在肺結核患者肺部各區域屬水平相對豐度的比較

圖3 肺結核患者肺部不同區域屬水平部分微生物的相對豐度差異

根據細菌的相對豐度和組間非參數Wilcoxon秩和檢驗P值(P<0.05)，確定了8種在肺結核患者肺組織中比較重要的微生物，它們在不同組織部位的相對豐度差異以箱型圖展示(圖3)。從圖中可以看出，Ochrobactrum(Z=2.31，P=0.021)和Brevundimonas(Z=2.31，P=0.021)在正常肺區的相對豐度高于壞死區。Sphingomonas(Z值分別為-2.89和3.02，P值均<0.05)和Kocuria(Z值分別為-3.75和3.58，P值均<0.05)在壞死區和肉芽腫區的相對豐度均高于正常肺區。Enhydrobacter(Z=-2.49，P=0.012)在壞死區的相對豐度高于肉芽腫區。Sphingobacterium(Z值分別為2.31和-2.78，P值均<0.05)在正常肺區的相對豐度高于壞死區和肉芽腫區。Tsukamurella(Z值分別為2.04和2.60，P值均<0.05)在正常肺區的相對豐度高于壞死區和肉芽腫區。Mycobacterium(Z值分別為-2.84和-2.79，P值均<0.05)在壞死區的相對豐度高于肉芽腫區和正常肺區。

同時，將成功配對的8例患者標本中上述8種重要微生物的相對豐度用折線圖展示(圖4)。從圖中可以看出，Ochrobactrum在正常肺的相對豐度與壞死區相比呈上升趨勢(Z=2.10，P=0.036)。Sphingomonas(Z值分別為-2.38和2.38，P值均<0.05)在正常肺區的相對豐度相比于壞死區和肉芽腫區下降。Enhydrobacter(Z值分別為2.10和-2.38，P值均<0.05)和Mycobacterium(Z值分別為2.10和-2.37，P值均<0.05)在壞死區的相對豐度相比于肉芽腫區和正常肺區上升。Sphingo-bacterium(Z值分別為2.52和-2.10，P值均<0.05)和Kocuria(Z值分別為-2.52和2.37，P值均<0.05)在正常肺區的相對豐度相比于壞死區和肉芽腫區上升。Brevundimonas和Tsukamurella的相對豐度沒有明顯變化。此外，配對樣品相對豐度結果表明肺結核致病菌Mycobacterium并不是肺結核患者肺中主要的微生物，這類致病菌主要存在于肺結核病灶的壞死區(表3)。

表3 主要微生物在肺結核配對患者肺部各區域屬水平相對豐度的比較

圖4 8例樣品配對肺結核患者肺部各區域屬水平部分微生物分布的變化趨勢

討 論

筆者探索了肺結核患者肺部不同組織區域配對樣品的微生物組特征。在屬水平上，壞死區和肉芽腫區微生物組分布特征未見統計學差異；而壞死區和正常肺區，肉芽腫區和正常肺區中微生物群落組成差異有統計學意義。研究表明，肺結核患者痰液中的微生物種類遠高于健康人群[8-9]，這與筆者研究結果基本一致。無論從門水平還是屬水平上，結核病肺部壞死區注釋到的物種都是最多的，這可能和壞死區組織形態結構改變有關。Cheung等[10]對肺組織新鮮標本的研究結果表明，肺部微生物在門水平上主要有Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes和Actinobacteria。這與筆者研究結果一致，即無論是在病灶區域，還是在遠離病灶的正常肺組織中，主要的微生物類群也為以上4種。此外，筆者還發現在肺部存在TM7類群并占據較高的相對豐度。目前TM7無法通過培養獲得，對其研究甚少。He等[11]從口腔中發現了TM7門，認為其會抑制巨噬細胞中的腫瘤壞死因子α(TNF-α)的誘導表達，從而抑制體內的免疫應答。

研究表明，肺部主要的微生物有Sphingomonas、Streptococcus、Prevotella和Veillonella等[1-2]。筆者采用肺部配對FFPE組織來直接反映肺部不同組織部位的微生物分布特征，結果表明無論是壞死區、肉芽腫區還是正常肺區，Ochrobactrum、Sphingomonas、Corynebacterium、Brevundimonas、Brevibacterium、Sphingobacterium和Enhydrobacter均為主要類群。Zhou等[12]研究發現，結核病患者患側肺和健側肺患者的肺部微生物組是相似的，這與筆者研究結果一致。此外，筆者發現即使是肺結核病灶的壞死區，Mycobacterium依然不是優勢菌種，這和很多實驗室的研究是一致的[12-15]。而對于結核病與正常肺之間微生物組屬水平的差異，筆者研究結果表明Sphingomonas、Enhydrobacter、Kocuria以及Mycobacterium的相對豐度從壞死區、肉芽腫區到正常肺區呈下降趨勢。Ochrobactrum和Sphingobacterium屬的相對豐度呈上升趨勢。之前已有學者利用新鮮樣本研究肺結核患者微生物分布特征。Wu等[14]研究表明，結核病患者痰液中Streptococcus、Pseudomonadaceae和Gramulicatella相對豐度較高。Krishna等[15]研究表明，結核病患者痰液中Rothia、Leuconostoc和Lactobacillu相對豐度較高。不同實驗室的研究結果并不完全相同，原因可能是肺部微生物組的特征受到地域、飲食、環境等很多因素的影響，并且個體之間也存在著一定差異。其次，Hahn等[16]研究表明，不同的測序儀或不同的擴增片段都會對結果造成影響。此外，以往研究者們大多使用痰液或支氣管灌洗液來研究肺部微生物組特征，這難以排除口腔菌群的影響。筆者使用FFPE樣品，與以往研究的樣本類型不同，可能也會對結果造成影響，但仍然需要進一步的研究。

對于肺結核患者而言，結核分枝桿菌是致病菌，在臨床病理工作中主要通過抗酸染色來診斷其感染，并且Mycobacterium主要存在于病灶的壞死區中。筆者通過高通量測序發現，Mycobacterium的相對豐度在壞死區最高，而在肉芽腫區和正常肺區中幾乎檢測不到，這與臨床實際情況相符。Botero等[9]也對結核分枝桿菌存在的位置進行過研究，結果表明其只存在于痰中，而不存在于口咽。

筆者通過使用配對樣品揭示了肺部常駐微生物組特征及肺結核患者肺部微生物組的變化。但依然存在一定的不足，首先本研究揭示了肺部微生物組在肺結核患者病灶區和正常肺中的分布特征，但并未對這些微生物的致病性做進一步研究。其次，本次研究樣本量較小，可能會對結果造成一定偏倚，這就限制了壞死區Mycobacterium與其他微生物類群相關性的研究。在未來的研究中，應擴大樣本量來探索肺結核患者病灶中微生物之間的相互作用關系，來明確Mycobacterium在感染過程中對正常肺部微生物組成的影響。

綜上所述，筆者使用肺結核手術患者的FFPE配對樣本，利用顯微切割技術，直接真實地展示了肺結核患者肺部病灶區和正常區的微生物組分布特征和差異。本次研究發現，肺結核患者肺部微生物組成在壞死區、肉芽腫區和正常肺區中有一定的分布規律，而致病菌結核分枝桿菌主要存在于壞死區中。不同病變區域微生物組群落差異與肺結核疾病的發生和發展可能有一定的相關性。