滿藥復(fù)方木雞顆粒抗菌和抗癌活性研究

金黎明，李春斌，權(quán)春善，侯熙彥，趙 晶，胡文忠

(1.生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116605；2.大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

滿藥復(fù)方木雞顆粒來源于滿族醫(yī)藥中治療肝病的傳統(tǒng)偏方“木雞湯”，由木雞(即云芝)和核桃楸皮兩味藥物組成，在原有藥物基礎(chǔ)上加入了具有扶正袪邪功效的山豆根、菟絲子，形成了現(xiàn)在的復(fù)方制劑，其中核桃楸皮為首次入藥的民族藥物[1-2]。經(jīng)過30多年的臨床應(yīng)用證明，該復(fù)方對慢性乙型病毒性肝炎、肝纖維化、肝硬化、肝腹水等各種肝病具有很好的治療效果，是目前國內(nèi)唯一的肝癌前期阻斷治療藥物，具有顯著的預(yù)防和治療肝癌作用[3-6]。

近年來，研究者對復(fù)方木雞顆粒對除肝癌細胞外的其他多種癌癥細胞的作用進行了研究，結(jié)果表明，其對人宮頸癌細胞株(Hela)、人肺腺癌細胞株(A549)、人急性早幼粒白血病細胞株(HL-60)、紅白血病細胞株(K562)和人Burkitt淋巴瘤細胞株(Raji)等都有一定抑制生長、誘導(dǎo)凋亡的作用[7]；對不同p53野生基因型的人結(jié)腸癌細胞(SW620p53mt、SW480p53mt、 HCT116p53wt)有明顯的抑制生長作用[8]；對艾氏腹水癌細胞有直接殺傷作用[9]。此外，對肝癌外的其他晚期惡性腫瘤都有一定的療效[10]。提示了復(fù)方木雞顆粒除防治肝病外，可能具有其他藥理作用。

本實驗研究了復(fù)方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌活性，以及對結(jié)腸癌細胞HT-29的抑制作用，為滿藥復(fù)方木雞顆粒功能的研究進一步補充了數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1 藥物

復(fù)方木雞顆粒，遼寧丹東藥業(yè)有限公司提供。

1.1.2 菌株、細胞與試劑

指示菌：金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌和白色念珠菌為實驗室保藏菌。

結(jié)腸癌細胞HT-29，購自中國科學(xué)院細胞庫。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母提取物5 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH約為7.0。

試劑：DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、四甲基偶氮唑鹽(MTT)，購于GIBCO公司。

1.1.3 儀器

SW-CJ-2FD潔凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；MT-180B生化恒溫培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；ZWY-A2102C雙層可編程恒溫?fù)u床(上海智誠分析儀器制造有限公司)；HERAcell150I二氧化碳培養(yǎng)箱(美國BTX)；LOGIC4 A2生物安全柜(美國LABCONCO)；SYNERGYH1多功能酶標(biāo)儀(美國BIOTEK)。

1.2 實驗方法

1.2.1 抗菌活性測定

采用瓊脂平板打孔法測試復(fù)方木雞顆粒的抗菌活性[11]。

用去離子水溶解復(fù)方木雞顆粒，在80 ℃水浴鍋中加熱30 min(滅菌并使藥品完全溶解)，將制備好的藥劑樣品在超凈工作臺中用連續(xù)10倍稀釋的方法，配制0.200、0.020、0.002 mg·mL-1三個不同質(zhì)量濃度，待用。

LB培養(yǎng)基融化后，室溫放置至40 ℃左右，接入供試菌種，倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用打孔器在平板內(nèi)的培養(yǎng)基上打4個孔，分別注入3個質(zhì)量濃度(0.200、0.020、0.002 mg·mL-1)的復(fù)方木雞顆粒溶液各200 μL，對照孔加入200 μL去離子水。

將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)，37 ℃條件下培養(yǎng)12 h，觀察抑菌圈的大小并測量抑菌圈的直徑，做好記錄。每個樣品重復(fù)3次，對所得結(jié)果進行分析。

1.2.2 體外抗腫瘤活性檢測

應(yīng)用MTT法檢測復(fù)方木雞顆粒對結(jié)腸癌細胞HT-29生長的抑制作用。將復(fù)方木雞顆粒用超純水溶解，配制成0.2 mg·mL-1，微孔濾膜過濾除菌待用。取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細胞HT-29，以2×104個·mL-1密度接種于96孔培養(yǎng)板中，加入樣品溶液100 μL，37 ℃，5% CO2條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48、72 h，空白對照組加入DMSO(使DMSO終濃度為0.03%)，每組重復(fù)3個復(fù)孔。于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加5 mg·mL-1MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。終止培養(yǎng)后，1 000 r·min-1離心10 min，吸取并棄掉培養(yǎng)液，在每孔中加入100 μL DMSO，震動10 min，使結(jié)晶物充分溶解，用自動酶標(biāo)儀測定570 nm波長下各孔的吸光度(A)，將A值作為反映結(jié)腸癌細胞HT-29的細胞活性及代謝狀況的參數(shù)[12]。

生長抑制率計算公式為

(1)

2 結(jié)果與討論

2.1 抗菌活性測定結(jié)果

用瓊脂平板打孔法研究復(fù)方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌活性，測定結(jié)果見表1。效果圖如圖1，其中1：對照，去離子水；2：0.002 mg·mL-1樣品；3：0.020 mg·mL-1樣品；4：0.200 mg·mL-1樣品。

表1 抑菌活性測定結(jié)果

(a)副溶血弧菌 (b)金黃色葡萄球菌 (c)白色念珠菌

復(fù)方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，質(zhì)量濃度為0.200 mg·mL-1的樣品對三種菌的抑菌圈分別為(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm；而在這三種濃度下，對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌都沒有顯示出抑制活性。

2.2 抗腫瘤活性測定結(jié)果

復(fù)方木雞顆粒對結(jié)腸癌細胞HT-29的生長抑制率如圖2。復(fù)方木雞顆粒對結(jié)腸癌細胞HT-29具有較明顯的抑制作用，隨著培養(yǎng)時間的增加，生長抑制率越來越高，培養(yǎng)72 h后，生長抑制率達到85.52%。

圖2 對結(jié)腸癌細胞HT-29的生長抑制率

復(fù)方木雞顆粒對結(jié)腸癌細胞HT-29培養(yǎng)72 h的生長抑制活性圖3。

(a)對照組 (b)實驗組

3 結(jié) 論

本實驗用瓊脂平板打孔法研究了滿藥復(fù)方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、白色念珠菌5種致病菌的抑菌性能。結(jié)果表明，復(fù)方木雞顆粒對金黃色葡萄球菌、副溶血弧菌、白色念珠菌具有抑制活性，0.2 mg·mL-1的樣品對三種菌的抑菌圈分別為(26.29±0.35)mm、(24.52±0.44)mm、(25.13±0.26)mm。此外，復(fù)方木雞顆粒對結(jié)腸癌細胞HT-29有較明顯的抑制作用，培養(yǎng)72 h后，生長抑制率達到85.52%。

近年來，國內(nèi)對民族藥的研究有升溫趨勢，但目前多集中在藏藥、蒙藥、苗藥等民族藥，對滿藥的研究尚不多見，亦沒有形成規(guī)模體系。復(fù)方木雞顆粒作為最著名的傳統(tǒng)滿藥之一，仍具有很大的研究價值和開發(fā)空間[1]。關(guān)于復(fù)方木雞顆粒的前期研究多集中在肝病治療方面，而本實驗研究了復(fù)方木雞顆粒的抑菌作用以及對結(jié)腸癌細胞HT-29的抑制作用，為復(fù)方木雞顆粒功能的進一步研究提供了數(shù)據(jù)。