老齡大鼠聽功能下降與線粒體DNA4834bp缺失突變的關系

黃海林 劉俊?

老年性耳聾是老年人中發生率較高的慢性疾病，是衰老在聽覺器官的表現。研究表明，衰老與線粒體功能紊亂密切相關，而線粒體功能紊亂是線粒體DNA突變引起的。Bai等［1］報道mtDNA4977缺失與老年性耳聾存在可能相關性。Fischel-Ghodsian等［2］檢測5例老年性耳聾患者膜迷路和螺旋神經節中mtDNA編碼的細胞色素氧化酶Ⅱ基因，發現老年性耳聾患者mtDNA突變率高于老年對照組，但突變發生的部位和數量均存在較大個體差異。常見的線粒體DNA缺失突變片段有 13162bp，10422bp，7663bp，7436bp，4989bp，4977bp，其中人mtDNA4977bp（對應大鼠4834bp）是mtDNA中最為常見突變類型［3］。2015年10月至2016年3月作者通過實驗研究，探討老年性聾發生的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，其中24個月齡SD大鼠10只，平均（647.83±10.35）g；3個月齡SD大鼠10只，平均（210.78±5.62）g，所有動物均無噪聲暴露史及其它藥物使用史，且無中耳炎，動物由華中科技大學同濟醫學院提供。

1.2 方法 （1）分組：20只SD大鼠經聽性腦干反應（ABR）檢測，排除中耳炎后按年齡分2組，各10只，24個月齡為觀察組；3個月齡為對照組。（2）檢測大鼠聽性腦干反應（ABR）反應閾：分別對對照組和觀察組大鼠進行ABR反應閾測定（測定方法參照孔維佳建立方法［4］）。測試前兩組大鼠用10%水合氯醛按照0.4ml/kg腹腔內注射麻醉，使用GSI Audera腦干誘發電位儀測試。（3）蝸神經核及內耳組織mtDNA提取：兩組動物ABR測試結束后立即麻醉斷頭處死，首先提取腦蝸神經核：于中線處剪開顱骨，將腦組織輕輕從顱骨中取出，根據蝸神經核［5］定位提取腦蝸神經核，置入勻漿器中，加入2ml勻漿液（pH7.4，0.01mol/L Tris-HCI，0.1mmol/L，0.01mol/L蔗糖）勻漿至無明顯組織塊存在（冰浴操作）。勻漿液4℃離心1000g l0min，取上清液0℃離心12000g 15min，棄上清液，沉淀物即為腦組織蝸神經核線粒體。然后提取內耳組織：提取雙側聽泡，置于4℃預冷的充氧無鈣鎂細胞外液中（0.1mol/L PBS，pH 7.4），體視顯微鏡下剝去骨性蝸殼，解剖出耳蝸Corti器，血管紋，螺旋神經節等內耳組織。蝸神經核和內耳組織線粒體DNA提取方法：各組織置入勻漿管，加入RIPA裂解液，再加入蛋白酶 K，至終濃度10mg/ml，搖勻混合，55℃水浴過夜消化。最后用酚-氯仿-異戊醇抽提取線粒體DNA，所得 DNA 溶于 50μl TE 溶液，-20℃保存備用。取2μl DNA樣本溶液稀釋至50μl，用紫外線核酸檢測儀器檢測A260/A280純度值并測定其濃度大小。（4）線粒體DNA缺失檢測分析：根據大鼠線粒體基因組全序列（Genbank序列號X 14848），并遵循引物設計原則，引物由上海生工生物工程公司合成：P1：5'-GCGAAGCTTAGAGCGTTAAC-3'，P2：5'-AGT GAG ATA AGG AAG CCT GC-3'，引物合成后用滅菌超純水稀釋成10μmol/L 的工作液，-20℃凍存。配制25μl PCR反應體系：Taq DNA 聚合酶（2.5U）0.5μl，引物（10μM） 各 1μl，dNTPs 2μl，PCR buffer2.5μl。PCR擴增反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，反應35個循環；末次72℃延伸7min。引物P1、P2如可以擴增597bp片段，則提示樣本中有mtDNA4834bp缺失。如樣本中無4834bp缺失突變，應在現實反應條件下無法合成近5000bp片段，故無法擴增出597bp PCR產物。（5）PCR產物鑒定與分析：各組PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，電泳緩沖液1 X TAE，電壓100V，用凝膠成像儀掃描成像并保存結果。在紫外燈下確定597bp目的基因條帶位置，將凝膠與產物一起切出，用DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN APGX-50G）分離純化。加樣后將離心管置37℃水浴1h，酶切產物經2. 5%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像儀掃描成像并保存結果。

1.5 統計學分析 采用SPSS18.0統計軟件。計量資料以（）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ABR反應閾 對照組大鼠ABR平均聽閾（19.50±3.69）dB， 觀 察 組 大 鼠 ABR平 均 聽 閾（46.00±3.94）dB，兩組差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 mtDNA4834bp缺失突變電泳結果 對照組大鼠腦組織蝸神經核樣本（10例）及內耳組織樣本（10只）均未檢測出597bp（提示4834bp缺失）擴增條帶（見圖1），觀察組大鼠蝸神經核樣本檢出率為100%；內耳組織樣本檢出率90.0%。見圖2。

圖1 對照組各組織標本PCR結果

圖2-1 觀察組蝸神經核組織mtDNA PCR結果

圖2-2 觀察組內耳組織mtDNA PCR結果

2.3 PCR酶切電泳 根據大鼠線粒體基因組全序列（Genbank序列號X 14848），根據DNASTAR軟件選擇限制性內切酶（HphⅠ）酶切，酶切位點見圖3，結果證實酶切產物來自mtDNA4834bp特異型缺失擴增片段，見圖4。

圖3 HphⅠ限制性內切酶酶切位點

圖4 PCR產物酶切電泳圖

3 討論

老年性耳聾發生機制目前尚不明確，大多學者認為其由多種危險因子的長期累積共同作用形成，其中最主要因素為衰老。根據Harman［6］提出衰老的自由基學說，認為衰老是由自由基引起的組織隨機毒害的結果，自由基損害作用的機制主要涉及DNA的損傷，尤其是mtDNA的氧化損傷，其持續產生于線粒體電子傳遞鏈的活性氧簇（ROS）是衰老過程中線粒體DNA氧化損傷產生的主要原因。由于mtDNA裸露于產生高氧自由基的線粒體內膜下，本身無組蛋白的保護又缺乏損傷修復系統，其突變率較核DNA高10～20倍［7］，極易受氧自由基的侵襲發生氧化修飾和mtDNA突變，由缺陷的mtDNA編碼的呼吸酶影響電子轉運功能，增加電子泄露，不斷產生的ROS又反過來繼續氧化損害線粒體功能，導致不同組織細胞程度不一的mtDNA累積突變的蓄積，即“老化的線粒體理論［8］”。衰老過程中產生的mtDNA缺失突變型mtDNA比完整的野生型mtDNA長度小［9］，復制速度快，其增殖優勢導致缺失突變型mtDNA分子比例隨年齡增長不斷累積增加。當細胞內突變mtDNA積累達到氧化磷酸化（OXPHOS）所生成的能量低于維持正常細胞功能閾值時，組織器官開始退化，出現臨床癥狀，引起老年退化性疾病，在聽覺器官表現為聽力逐漸下降。本實驗中對照組大鼠ABR平均聽閾為（19.50±3.69）dB peSPL，觀察組大鼠ABR平均聽閾（46.00±3.94）dB peSPL，兩組間差異有統計學意義（P＜0.05）。

老年性聾是機體衰老過程在聽覺器官的表現。研究發現線粒體DNA突變與老年性耳聾的發生關系密切。人類mt DNA 在8483～13459bp之間存在著13bp的重復序列，在氧化應激刺激下，易發生斷裂，在修復時由于兩端重復序列，產生DNA兩條鏈下游環，該堿基環富含鳥嘌呤堿基，對自由基及其敏感，一旦受到ROS攻擊，該環降解即容易導致“誤認”發生了4977bp片段缺失［10］，此機制被稱為線粒體重組滑行錯配學說。此缺失在大鼠，mtDNA8103-12937bp之間存在16bp直接重復序列，故大鼠也存在類似缺失突變（mtDNA4834bp）的常見缺失（CD）。突變不僅存在衰老組織中（心肌、肝、腦、肺、腎等），還可存在于線粒體腦肌病、進行性眼外肌麻痹和Kearns-Sayre綜合征等疾病中，且隨著年齡增加在組織中逐漸積累［11］。本實驗PCR擴增出597bp片段（提示mtDNA4834bp缺失），該缺失突變編碼包括ND3，ND4，NDS，COIII，ATPaseB，ATPase6 等［12］基 因，影響呼吸鏈有關亞單位蛋白的合成，從而形成有缺陷的呼吸鏈，ATP產生不足導致蝸內離子失平衡，內環境紊亂，最終導致內耳毛細胞非特異性損害，引起聽力下降［13］。本實驗在大鼠蝸神經核和內耳組織中均發現了mt4834bp缺失，表明該常見缺失普遍存在于衰老組織。因此以后可以通過減少和預防mtDNA缺失突變的發生，以緩解和預防老年性耳聾發生發展，從而為治療老年性耳聾提供新突破。但老年性聾不一定均有mtDNA4834bp片段缺失，本實驗中觀察組有1只未檢測到該缺失突變，表明除了基因背景以外，還有其他環境易感因素（如藥物，噪音等）在老年性聾的發病過程中起重要作用，具體機制有待于進一步的研究。