黃芩莖葉黃酮提取物對血管癡呆性大鼠Tau蛋白表達的影響

曹巖菁 吳佳麗? 李鵬 馮莉 王琴 任謙

血管性癡呆（VD）［1］是多種腦血管因素導致，主要以記憶、認知功能損害，同時伴有語言、運動、人格等多方面障礙的綜合征。目前，關于血管性癡呆的治療仍是亟需解決的難題。多年來，國內外研究人員發現，中藥黃芩莖葉黃酮（SSTF）不僅能對老年性記憶缺陷有明顯的改善作用［2］，且對血管性記憶障礙的改善也有同效，然而其具體作用機制尚不明確。2015年6月至2016年1月作者通過實驗研究，探討不同劑量SSTF對VD大鼠模型的行為學及其對p-tau、PP2A、GSK3β蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗試劑和材料 SD 大鼠（清潔級）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；0.9%氯化鈉注射液（浙江莎普愛思藥業股份有限公司）；注射用青霉素鈉（江西省科達動物藥業有限公司）；碘伏（德州欣瑞達消毒制品有限公司）。SSTF提取物購自河北承德醫學院藥理研究室（Lot No. 010608）。藥物純度≥62%。

1.2 實驗動物及分組 SD大鼠60只（19month，平均230～270g，雌、雄各半）。排除有游泳障礙的大鼠。隨機將大鼠分成正常組、假手術組及模型組（SSTF-50：術后8d予50mg/kg的SSTF喂養至68d。SSTF-100：術后8d給予100mg/kg SSTF喂養至68d）。BCCAO法造模。假手術組步驟同上，僅分離雙側頸總動脈不阻斷血流，術后8d給予0.9%生理鹽水至68d［10ml/（kg·d）腹腔注射］。正常組不做任何處理，給予0.9%生理鹽水至 68d［10ml/（kg·d）］。去除死亡大鼠。

1.3 Morris水迷宮實驗 采取Morris水迷宮實驗對大鼠進行行為和認知功能測試。記錄正常組、模型組及藥物干預組四組在術后63～68d Morris 迷宮實驗的結果。通過軟件追蹤記錄分析，評價大鼠的記憶能力及腦缺血損傷模型對記憶的印象等。癡呆標準：對照組大鼠模型逃避時間的均值為參考值，計算實驗各組大鼠各時段平均逃避潛伏期與參考值之間差值占該大鼠的平均逃避潛伏期的比值，如＞20%定為模型成功。

1.4 Western blotting檢測 術后12周，選取每組9只進行斷頭取腦，4%甲醛固定，行免疫組化檢測。將大鼠斷頭取腦，冰上分離大腦皮層和海馬，液氮速凍，于-80℃保存，行Western blotting檢測。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（），用t檢驗。水迷宮實驗中逃避潛伏期及游行距離間的差異使用two-way ANOVA分析和post-hoc檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組VD大鼠認知功能障礙比較 見圖1。

圖1 各組大鼠認知功能障礙

2.2 各組大鼠tau蛋白磷酸化的水平比較 見圖2。

圖2 各組大鼠tau蛋白磷酸化水平比較

2.3 SSTF對GSK3β蛋白表達活性的影響 見圖3。

2.4 各組大鼠Cdk5、p35、p25蛋白的表達比較 見圖4。

2.5 各組大鼠PP2A蛋白表達比較 見圖5。

圖3 各組大鼠GSK3βSer9蛋白的表達比較

圖4 各組大鼠Cdk5、p35、p25蛋白表達比較

圖5 各組大鼠PP2A蛋白表達比較

3 討論

本研究以BCCAO動物模型為基礎，觀察了動脈栓塞后大鼠腦組織廣泛慢性缺血狀態下的動物行為學的特點。結果顯示，在水迷宮試驗的訓練階段，隨著訓練次數的增加，與正常對照組大鼠相比，癡呆組大鼠的逃避潛伏期明顯延長；探索試驗中，癡呆組大鼠穿越平臺的次數明顯減少。同樣，與正常組比較，癡呆組大鼠在象限中游行距離的百分比也明顯縮短。表明在慢性缺血60d后，大鼠表現為明顯的學習及空間能力的障礙。給予SSTF提取物100mg/kg干預治療后，能夠明顯縮短癡呆組大鼠逃避潛伏期的時間，增加大鼠穿越平臺的次數，延長大鼠在象限中游行的距離，最終達到改善大鼠認知功能障礙的目的，表明100mg/kg是SSTF提取物能夠產生效用的最小劑量。

本資料顯示，隨著缺血時間的不斷延長，磷酸化的tau蛋白在大鼠額葉皮層及海馬中表達明顯增加。而當給予100mg/kg的SSTF干預治療后，癡呆組大鼠腦額葉皮層及海馬磷酸化tau蛋白的水平明顯下降。以往研究表明，Tau蛋白過度磷酸化是癡呆及記憶障礙發生的主要病理機制之一，過度磷酸化的tau蛋白有助于Aβ和神經纖維纏結的形成［3］，而后者又加重了缺血性卒中后的神經損傷和細胞凋亡。鑒于磷酸化tau蛋白與疾病的進展關系密切，SSTF是否能夠通過降低tau蛋白的過度磷酸化水平，而改善癡呆大鼠的認知功能障礙的機制還需進一步深入研究。

眾所周知，一些酶的家族，尤其是激酶，在tau蛋白磷酸化過程中扮演重要角色。雖然，GSK3β（S199、T231、S396、S413） 和 Cdk5（S202、T205、S235、S404）具有相似的磷酸化激活位點［4］，然而二者的作用機制卻有較大的區別。Cdk5蛋白的基礎活性較低，需要激活物才能激活，除此之外，Cdk5位于胞漿內，而其生理激活物P35蛋白卻是膜相關蛋白。只有在P35鈣蛋白酶水解生成P25釋放至胞漿時，才能進一步激活Cdk5蛋白［5］。這提示GSK3β與Cdk5對tau蛋白磷酸化的作用機制不同。本資料顯示，當給予100mg/kg的SSTF干預治療后，GSK3β和Cdk5蛋白的表達在正常組，假手術組及藥物干預組四者間無明顯差異，表明SSTF黃酮提取物不能影響癡呆大鼠腦GSK3β和Cdk5蛋白的表達。然而，對于磷酸化的糖原合成酶激酶-3β（p-GSK3β），其水平在血管癡呆性大鼠腦額葉皮層及海馬中表達明顯下降，表明在慢性缺血致腦損傷后，GSK3β在缺血大鼠大腦皮層及海馬內的表達呈動態變化，下降的p-GSK3β可能參與慢性全腦缺血狀態下的大鼠認知功能障礙的發生。進一步，SSTF提取物100mg/kg干預治療后，血管癡呆組大鼠大腦皮層和海馬內p-GSK3蛋白的表達明顯增高。而p35的表達，本資料結果表明，癡呆組大鼠腦皮層及海馬內的p35蛋白表達明顯增高，p25蛋白在血管性癡呆大鼠腦內表達明顯增高，100mg/kgSSTF提取物后，能夠明顯降低p35，p25蛋白的表達水平。表明SSTF提取物參與了對GSK3β和Cdk5蛋白活性的調節，從而導致了tau蛋白在不同位點的磷酸化水平的降低。

PP2A是一種廣泛存在于真核細胞內的，絲氨酸／蘇氨酸磷酸酯酶中極為重要的一種蛋白磷酸酯酶，在細胞功能的諸多方面均起著相當重要的作用，直接或間接參與了細胞的新陳代謝、信號轉導、DNA復制、蛋白合成、生長發育及凋亡等活動方式。本資料顯示，慢性腦缺血致認知功能障礙大鼠的腦皮層及海馬中，PP2A-sub B蛋白的表達明顯下降，表明PP2A參與了缺血狀態下的大鼠認知功能障礙的發生。而這些變化似乎均與tau蛋白有關，tau蛋白是PP2A作用的底物，當PP2A活性降低時能夠抑制tau蛋白的去磷酸化，而tau蛋白在過度磷酸化后會形成NFT，進一步影響大腦的認知功能［6］。進一步分析發現tau蛋白過度磷酸化可能與GSK3β，PP2A的表達失衡有關。而給予一定濃度和劑量的SSTF后，顯著改善GSK3β和PP2A間的平衡，從而降低缺血大鼠大腦皮層及海馬內磷酸化tau蛋白的水平，繼而改善大鼠的記憶功能。