松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲的毒力及對其Na+,K+-ATP酶活力的影響*

姚陳霞， 劉亞飛， 黃金龍， 阮永明

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004；2.云南森美達生物科技有限公司,云南 楚雄 675100)

松油烯-4-醇(Terpinen-4-ol)廣泛存在于多種植物精油中，且是大多數植物精油的主要成分.目前發現水蒸氣提取物中含有松油烯-4-醇成分的植物已有80余種，其中從柏科、菊科、姜科和唇形科等植物提取的精油中，松油烯-4-醇所占比例非常高.Kaul等[1]發現從菊蒿(Tanacetumlongifolium)根部提取的黃色精油中主要成分為松油烯-4-醇，占總成分的25.8%，Bordoloi等[2]通過水蒸氣蒸餾法使卡薩蒙納姜(Zingibercassumunar)根中所含成分分離出來，發現其松油烯-4-醇的含量為50.5%.

國內外關于松油烯-4-醇對衛生害蟲和農業害蟲的作用研究有很多.如 Cowles 等[3]發現松油烯-4-醇對蔥蠅(Deliaantigua)等昆蟲有忌避作用，而且對不同種類的昆蟲具有明顯的觸殺和熏蒸毒力.Tighe等[4]發現松油烯-4-醇對蠕形螨(DemodexfolliculorumandD.brevis)生物活性具有強烈的抑制作用，是導致其死亡的主要原因.陳根強等[5]發現松油烯-4-醇對不同昆蟲如家蠅(Muscadomestica)、玉米象(Sitophiluszeamais)、粘蟲(Mythimnaseparata)、小菜蛾(Plutellaxylostella)和赤擬谷盜(Triboliumcastaneum)的熏蒸毒力有所差別，對鱗翅目昆蟲的熏蒸毒力更為明顯.松油烯-4-醇作用于供試昆蟲后，試蟲一般都依次表現為興奮、痙攣、麻痹和死亡4個階段.一般認為，比較快的中毒死亡大部分都是由于藥物直接作用于神經系統.松油烯-4-醇作用于供試昆蟲后，供試昆蟲表現出的中毒癥狀與六六六、環戊二烯類等藥劑作用于昆蟲后的中毒癥狀非常相似，都具有典型的神經毒劑特征[6].

陳根強等[7]觀察了松油烯-4-醇對粘蟲幼蟲體壁結構的影響，發現松油烯-4-醇熏蒸處理會導致粘蟲體表的蠟質層顆粒溶解，并對氣門和體壁有不同程度的破壞.馬志卿等[8-10]測定了松油烯-4-醇對粘蟲體內幾種酶的影響，研究表明，松油烯-4-醇可以激活血淋巴酯酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶，而抑制了Na+,K+-ATP酶、谷胱甘肽S-轉移酶和過氧化物酶的活性；馬志卿等[11-12]發現松油烯-4-醇主要是通過抑制昆蟲體內Na+,K+-ATP酶的活性使昆蟲中毒乃至死亡，供試昆蟲體內Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，導致Na+,K+和Ca2+等離子的運輸出現混亂，并釋放一些神經遞質使機體出現中毒癥狀.陳根強[13]發現松油烯-4-醇主要是通過干擾Na+通道的正常開閉來抑制Na+,K+-ATP酶活性，從而使神經傳導紊亂然后發生一系列中毒反應，抑制的同時還伴有試蟲大量失水并引起血淋巴理化性質的改變.為進一步探索松油烯-4-醇的殺蟲機理、研發新型生物農藥做好基礎研究，本實驗測定了松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸和觸殺毒力，并進一步測定了其對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 主要試劑

松油烯-4-醇(純度99%，由云南森美達生物科技有限公司提供)；ATP酶測試盒(購自南京建成生物工程研究所)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(購自碧云天生物技術公司).

1.1.2 供試昆蟲

蠶豆蚜(Aphiscraccivora)：室內長期以蠶豆苗飼養(溫度：(25±1) ℃；濕度：70%～80%；光照/黑暗：16 h/8 h)的敏感種群，挑選個體大小發育一致、活性良好的無翅成蚜供試.

1.2 試驗方法

1.2.1 熏蒸毒力測定

松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲的熏蒸毒力測定用錐形瓶熏蒸法[14].把大小一致的無翅成蚜接入錐形瓶(V=300 mL)中，瓶塞中央插入大頭針，把長為4 cm、寬為2 cm的濾紙條固定在大頭針頂端，懸掛在瓶口上.用丙酮作為溶劑把松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍，用移液器分別向濾紙條上滴加一定量不同稀釋倍數的試劑，對照組滴加等量丙酮，滴加之后快速蓋上瓶塞.每種試劑分別處理50頭蚜蟲并重復3次.根據錐形瓶體積和滴加試劑的體積可算出不同稀釋倍數下松油烯-4-醇的濃度.只滴加松油烯-4-醇時，所含松油烯-4-醇的濃度為69.975 0 mg/L；將松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍時，所含松油烯-4-醇的濃度為6.997 5，3.498 7，1.749 3和0.874 6 mg/L.將錐形瓶置于養蟲室，8 h后檢查死亡的蚜蟲數，統計出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回歸方程，并用SPSS統計分析軟件對方程進行卡方檢驗，求出8 h的致死中量(LC50)和95%置信區間[15].

1.2.2 觸殺毒力測定

用丙酮作為溶劑把松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍，用移液器點滴0.5 μL到蚜蟲的前胸背板，每種試劑分別處理50頭蚜蟲并重復3次.對照組點滴等量的丙酮[16].根據丙酮和松油烯-4-醇的密度可求出不同稀釋倍數下松油烯-4-醇的施藥量.只滴加松油烯-4-醇時，其每頭施藥量為466.500 0 μg；將松油烯-4-醇稀釋至10，20，40和80倍時，每頭松油烯-4-醇的施藥量為46.650 0，23.325 0，11.662 5和5.831 2 μg.8 h后檢查死亡的蚜蟲數，統計出死亡率及校正死亡率，然后用概率值分析法和Excel表格求得毒力回歸方程，并用SPSS統計分析軟件對方程進行卡方檢驗，求出8 h的致死中量(LD50)和95%置信區間[15].

1.2.3 酶活力測定方法

將經過熏蒸和觸殺處理的無翅成蚜分別進行Na+,K+-ATP酶活性測定.將經過試劑處理的無翅成蚜，加入2 ml預冷的0.01 mol/L Tris-Hcl(pH 7.0)，冰浴研磨，然后高速離心(10 000 r/min)15 min，取上清液進行蛋白濃度測定和 Na+,K+-ATP酶活性測定[17].

Na+,K+-ATP活性測定參照Na+,K+-ATP酶試劑盒說明書進行.蛋白含量的測定參照BCA測試盒說明書進行.

2 結果與分析

2.1 熏蒸毒力測定結果

松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力結果見表1.松油烯-4-醇對蚜蟲有顯著的熏殺作用，且隨著濃度的增加，熏殺效果越強.根據表1中的數據計算出松油烯-4-醇對蚜蟲的毒力回歸線，結果見表2.

表1 松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力測定結果(8 h)

表2 松油烯-4-醇對蚜蟲的熏蒸毒力回歸線(8 h)

2.2 觸殺毒力測定結果

松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力結果見表3.松油烯-4-醇對蚜蟲有顯著的觸殺作用，且隨著濃度的增加，觸殺效果越強.根據表3中數據計算得出松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力回歸線，結果見表4.

表3 松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力測定結果(8 h)

表4 松油烯-4-醇對蚜蟲的觸殺毒力回歸線(8 h)

2.3 Na+,K+-ATP酶活性測定結果

2.3.1 熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響見表5.測定結果表明，經過熏蒸處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性具有顯著的抑制作用，且隨著松油烯-4-醇濃度的增加，抑制作用越強.

表5 松油烯-4-醇熏蒸對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

注：標準曲線方程：y=0.019 6x+0.088 8,R2=0.999 2.

2.3.2 觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶的活性的影響見表6.測定結果表明，經過觸殺處理后，松油烯-4-醇對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性具有顯著的抑制作用，且隨著松油烯-4-醇濃度的增加，抑制作用越強.從表5和表6可知，松油烯-4-醇稀釋后，觸殺對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的抑制均高于熏蒸；而松油烯-4-醇直接作用于蚜蟲時，觸殺和熏蒸對Na+,K+-ATP酶活性的抑制作用幾乎相同.

表6 松油烯-4-醇觸殺對蚜蟲Na+,K+-ATP酶活性的影響

注：標準曲線方程：y=0.023 6x+0.091 4,R2=0.995 9.

3 討論

神經毒劑殺蟲劑一般作用于害蟲的神經系統，影響害蟲神經的傳導，來達到殺死害蟲的目的.比如雙對氯苯基三氯乙烷和除蟲菊酯等阻遏昆蟲軸突的傳導；六氯環己烷和六氯-環氧八氫-二甲撐萘等阻遏神經遞質乙酰膽堿的傳導.這幾種殺蟲劑都是通過阻礙害蟲的神經傳導，使害蟲出現一系列中毒癥狀，包括興奮、抽搐痙攣、運動失調和麻痹等，直至死亡[18-19].陳根強等[5]研究發現,松油烯-4-醇作用于家蠅成蟲后也會表現出上述中毒癥狀.而本研究觀察到松油烯-4-醇作用于蚜蟲后也會出現一系列神經中毒癥狀，其癥狀與松油烯-4-醇對家蠅和滴滴涕、擬除蟲菊酯類等神經毒劑處理的昆蟲相似[6].

ATP酶可以調節細胞膜內外兩側離子的濃度使其平衡，來保持細胞的靜息電位.Na+,K+-ATP酶具有維持細胞膜內外Na+和K+濃度平衡的作用，其活性發生改變后，就會顯著影響細胞的穩定，使細胞的代謝發生錯亂.研究表明，擬除蟲菊酯類殺蟲劑主要是通過影響昆蟲神經系統中Na+,K+-ATP酶的活性從而導致昆蟲死亡[20-21].Na+,K+-ATP酶活性被抑制后，試蟲機體很快就會出現一系列反應，隨后就會出現神經中毒的癥狀[22].本研究發現，松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲熏蒸和觸殺處理后，都會顯著抑制Na+,K+-ATP酶的活性，且觸殺的抑制效果大于熏蒸的抑制效果.結合馬志卿等[23-24]的研究結果：松油烯-4-醇對粘蟲和家蠅的Na+,K+-ATP酶的活性也都具有良好的抑制作用，所以，松油烯-4-醇的主要作用靶標極有可能是Na+,K+-ATP酶.目前其殺蟲機理還不清楚，推測可能與擬除蟲菊酯類殺蟲劑相似，還需進一步研究.

遲家家等[25]測定了吡蟲啉、高效氯氰菊酯、阿維菌素、毒死蜱和吡蚜酮等幾種殺蟲劑對豆蚜的毒力大小(24 h)，其LC50值分別為0.247,0.262,0.381,0.386,35.710 mg/L.本實驗測得松油烯-4-醇對蠶豆蚜蟲的LC50和LD50值分別為4.834 2 mg/L,10.282 7 μg/aphid.所以，松油烯-4-醇對蚜蟲具有很強的熏蒸和觸殺毒力.目前化學農藥的泛濫使用及其帶來的環境問題，使人們意識到尋找和研發新型生物農藥的重要性.新農藥研發主要是通過從已知的天然產物中提取有殺蟲活性的成分，松油烯-4-醇廣泛存在于多種植物精油中，且該化合物對人、畜及環境都安全[26-27]，可以嘗試利用該化合物開發合成出更安全高效且對環境無污染的新型植物源農藥.