防風-烏梅含藥血清對血小板衍生因子誘導人支氣管平滑肌細胞增殖與細胞周期的影響機制研究

龍聲志，吳賢波，朱海燕，陳 林，謝毅強，楊 帆

（1.貴陽中醫學院研究生院，貴陽 550002；2.成都醫學院附屬新都中醫院，成都 610500；3.成都醫學院第一附屬醫院中西醫結合科，成都 610500；4.海南醫學院中醫學院，海口 571199）

哮喘是常見的慢性呼吸系統疾病，嚴重危害人類健康。氣道重塑是哮喘發病機制中的重要環節，氣道平滑肌細胞（Airway smooth muscle cells，ASMCs）的異常增殖與細胞周期的異常調節在哮喘氣道重塑過程中具有重要意義。ASMCs的增殖能使氣道壁增厚，導致支氣管對刺激的收縮反應增強，進一步加重氣道高反應性。高偉良等[1]發現哮喘氣道重構時，ASMCs增殖分裂活動活躍，增殖狀態下的細胞比例增多。因此，抑制ASMCs異常增殖、調控細胞周期轉換對控制哮喘氣道重塑極其重要。防風-烏梅作為藥對配伍具有祛風解痙、斂肺生津功用，源于《祝諶予經驗集》過敏煎中的君臣配伍[2]，常被用來治療支氣管哮喘、蕁麻疹等過敏性疾患。課題組前期動物實驗研究發現，防風-烏梅配伍可能通過抑制支氣管平滑肌肥厚、減少相關活性物質分泌，進而抑制小鼠哮喘模型氣道重塑。此次研究采用血小板衍生因子（Platelet derived growth factor，PDGF）來誘導人支氣管平滑肌細胞（Human bronchial smooth muscle cells，HBSMC）增殖，觀察中藥防風-烏梅配伍對HBSMC增殖與細胞周期的影響，并從腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factoralpha，TNF-α）、白細胞介素 -8（Interleukin-8，IL-8）的分泌情況，探討防風-烏梅對HBSMC增殖與細胞周期的作用機制，為進一步研究中藥配伍對氣道重塑的抑制機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠20只，購于上海富萊生物科技有限公司，體質量220～250 g，合格證編號：2015000525917。

1.2 藥物 中藥防風、烏梅購于成都杏林大藥房，經成都中醫藥大學中藥鑒定教研室盧先明教授鑒定，防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根；烏梅為薔薇科植物烏梅Prunus mume（Sieb.）Sieb.et Zucc的干燥成熟果實。防風、烏梅（臨床成人用量均為15 g/d），防風-烏梅（臨床成人用量為30 g/d，防風、烏梅劑量比為1:1）；吸入用布地奈德混懸液購于AstraZeneca公司，Lot 320341。

1.3 主要試劑及儀器 細胞系來源：HBSMC，細胞株購自Sineell公司，Catalog b3400。試劑：高糖DMEM培養基（Shanghai BasalMedia Technologies Co，LTD.，批號：L110）、PDGF（sino Biological，批號：10572-H07Y）、CCK-8試 劑 盒（Beyotime， 批 號：C0038）、細胞周期檢測試劑盒（Beyotime，批號：iC1052）、TNF-α ELISA Kit （ LIUHEBIO，批號：LHE10183HU）、IL-8 ELISA Kit （LIUHEBIO， 批 號：LH-E10104HU）。儀器：超凈臺（蘇州凈化設備有限公司，型號：SW-CJ-1D）、相差顯微鏡（OLYMPAS，型號：IX71）、CO2培養箱（Thermo fisher，型號：3111）、離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：L400）、流式細胞儀（BD Bioscience，型號：FACS Calibur）、酶標儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司，型號：RT-6100）。

1.4 含藥血清的制備 取雄性SD大鼠20只，根據隨機數字表法隨機分為空白對照組、防風組、烏梅組、防風-烏梅組[按生藥15.425 g/（kg·d）、15.425 g/（kg·d）、30.850 g/（kg·d）藥液灌胃 ]，按實驗動物與人體標準體質量計算公式換算給藥劑量，空白組給予生理鹽水，3次/d，1 mL/次，給藥3天后禁食8 h，第4天末次給藥1 h后予7%水合氯醛麻醉，無菌操作下打開腹腔，于腹主動脈取血。血樣常溫放置1 h，2 000 rpm離心15 min，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝于EP管中，- 20 ℃保存。使用前合并各組血清，56 ℃水浴滅活30 min。

1.5 細胞模型建立 參照王超智等[3]方法通過20 ng/mL PDGF刺激誘導HBSMC增殖。取4代對數生長期的HBSMC，胰酶消化后以5×104細胞密度接種于培養版，37 ℃5% CO2培養箱培養。細胞融合度為70%～80%時，更換DMEM培養基繼續培養24 h，使細胞同步化于G0期。

1.6 細胞分組 按下列分組對細胞進行相應處理：空白對照組（10%FBS、DMEM）；細胞模型組（20 ng/mL PDGF、10%FBS、DMEM）；正常大鼠血清組（10%正常大鼠血清、DMEM）；正常大鼠血清細胞模型組（10%正常大鼠血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；激素干預組（10-6mol/L布地奈德、20 ng/mL PDGF、DMEM）；防風血清組（10%防風血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；烏梅血清組（10%烏梅血清、20 ng/mL PDGF、DMEM）；防風-烏梅血清組（10%防風-烏梅血清、20 ng/mL PDGF、DMEM），37 ℃ 5%CO2培養箱繼續培養。

1.7 CCK-8檢測HBSMC增殖情況 種板前確保細胞狀態良好，將處于對數生長期的HBSMC用胰酶消化后，完全培養基重懸成為細胞懸液，將其傳代至96孔板里，每孔的細胞密度為5×103，配制5%、10%、20%三個不同濃度的防風血清、烏梅血清、防風-烏梅血清分別和20 ng/mL含PDGF的DMEM完全培養基作用于細胞48 h后，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力；選取藥物血清抑制細胞增殖的效果最好的藥物濃度，分別作用于細胞24、48、72 h后，使用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。

1.8 流式細胞檢測細胞周期 胰酶消化對數生長期的目的細胞后，完全培養基重懸成細胞懸液，傳代至6孔板里，每孔密度為1×106，次日給細胞加藥（根據MTT實驗篩選的濃度），培養48 h后收集細胞，加入預冷的70%乙醇（PBS配制），4 ℃固定過夜，離心收集細胞，以1 mL預冷的PBS洗細胞一次，加入預冷的 PBS重懸細胞，調整細胞濃度為1.0×106，取出100 μL細胞懸液，加入RNase A酶，使RNase A終濃度為1 mg/mL，混勻后37 ℃水浴30 min，加入PI綜合染色液，使PI終濃度為50 μg/mL，混勻，流式細胞儀檢測。

1.9 Elisa技術檢測細胞培養上清液中TNF-α、IL-8表達 具體操作分別按照TNF-α ELISA Kit、IL-8 ELISA Kit 使用說明書嚴格操作，測出吸光度，描繪標準曲線，計算濃度。

1.10 統計學方法 使用統計軟件SPSS 16.0分析，數據以均數±標準差（±s）表示，多組均數比較用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法，方差不齊則使用Dunnetts T3法，P＜ 0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞增殖能力的影響 見圖1。

圖1 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞增殖能力的影響

2.2 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞增殖率的影響 見表1。

表1 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞增殖率的影響（±s，n = 8） %

表1 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞增殖率的影響（±s，n = 8） %

注：與細胞模型組、正常大鼠血清細胞模型組比較，# P＜0.05；與防風-烏梅血清組、激素干預組比較，△P＜0.05

組 別 增殖率空白對照組 100.00±2.71#△細胞模型組 138.05±5.5△正常大鼠血清組 93.60±1.34#△正常大鼠血清細胞模型組 139.55±4.05△激素干預組 116.50±2.45#防風血清組 132.71±3.18△烏梅血清組 126.20±3.76#△防風-烏梅血清組 115.57±3.68#

2.3 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞周期的影響 見表2。

表2 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞周期的影響（±s，n = 8）

表2 防風-烏梅含藥血清對HBSMC細胞周期的影響（±s，n = 8）

注：與細胞模型組、正常大鼠血清細胞模型組比較，# P＜0.05；與防風-烏梅血清組、激素干預組比較，△P＜0.05

組 別 G0/G1 G2/M S空白對照組 73.05±1.01#△ 3.53±.078#△ 23.42±1.61#△細胞模型組 55.12±1.08△ 13.54±0.80△ 31.35±1.81△正常大鼠血清組 74.57±0.88#△ 4.14±0.19#△ 21.29±0.75#△正常大鼠血清細胞模型組 54.39±0.97△ 10.93±0.68△ 34.69±1.44△激素干預組 62.18±0.86# 10.81±1.37 27.01±1.68#防風血清組 62.29±0.87# 6.93±0.78#△ 30.79±1.22△烏梅血清組 72.80±1.16#△ 5.76±0.94#△ 21.44±2.08#防風-烏梅血清組 63.99±1.54# 13.49±0.88 22.53±1.81#

2.4 防風-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達的影響 見表3。

表3 防風-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達的影響（±s，n = 8） pg/mL

表3 防風-烏梅含藥血清對HBSMC TNF-α、IL-8表達的影響（±s，n = 8） pg/mL

注：與細胞模型組、正常大鼠血清細胞模型組比較，# P＜0.05；與防風-烏梅血清組、激素干預組比較，△P＜0.05

組 別 TNF-α IL-8空白對照組 129.28±1.27#△ 198.74±5.42#△細胞模型組 984.22±45.84△ 2031.16±69.51△正常大鼠血清組 148.47±19.36#△ 230.22±25.81#△正常大鼠血清細胞模型組 920.40±44.77△ 2117.72±86.75△激素干預組 460.30±66.72# 509.12±57.76#防風血清組 885.53±1.46△ 794.04±27.33#△烏梅血清組 862.95±17.25△ 847.26±89.23#△防風-烏梅血清組 640.60±1.48# 554.45±48.04#

3 討論

哮喘是由多種細胞及其細胞組分參與的慢性氣道炎癥，ASMCs增殖在哮喘氣道重塑形過程中具有十分重要的地位[4]。氣道重塑會出現ASMCs增生、肥大、細胞間質重塑等病理改變，哮喘發作時ASMCs作為重要的效應細胞，在多種細胞因子、炎性介質的作用下產生收縮、增殖、遷移等一系列生物學效應[5]。研究[6-7]發現PDGF可促進ASMCs釋放炎癥因子和細胞因子，導致氣道重塑和氣道高反應性，進而又引起炎性細胞募集并活化，擴大炎癥反應，繼續影響ASMCs增殖，故常用其誘導ASMCs增值。本研究結果表明，細胞模型組、正常大鼠血清細胞模型組細胞增殖能力相比空白對照組、正常大鼠血清組明顯提高（P＜0.05），提示PDGF刺激HBSMC可使其細胞增殖能力增強，與上述研究相符；各給藥組均表現出對細胞增殖能力的抑制作用，而防風-烏梅血清組與激素干預組的抑制效果要優于防風血清組和烏梅血清組（P＜0.05），提示防風-烏梅配伍含藥血清能更好抑制ASMCs增值。細胞周期調節對細胞增殖起著重要的作用[8]，哮喘發作時，胞外各種絲裂原可通過不同的信號轉導途徑促進ASMCs增殖，若能阻斷細胞完成細胞分裂周期，便能達到控制或逆轉氣道重塑的目的[9]。細胞周期具有兩個關鍵限制點，即G1/S期和G2/M期[10]，決定了細胞周期進程的速度和方向，準確、有序地進出各個周期時相是細胞正常生長、代謝的關鍵。一般情況下，細胞無增殖活動時皆停留于G0期，在絲裂原等因素刺激下，一些細胞進入S期，通過G2期及M期，即進入增殖周期。本研究結果表明，各給藥組均能增加G0/G1期細胞比例，以烏梅血清組最佳，烏梅血清組與防風-烏梅血清組能顯著減少S期細胞數，提示烏梅血清組與防風-烏梅血清組均能阻滯細胞周期進展。

ASMCs是各種炎癥細胞因子、趨化因子的來源。TNF-α是一種重要的促炎細胞因子，在哮喘氣道病理學中發揮重要作用，是難治性哮喘中重要潛在因素[11]。TNF-α可用來誘導的血管平滑肌細胞（VSMCS）增殖[12]，促進VSMC由G0/G1期進入S期[13-14]。哮喘患者存在較高的TNF-α的表達，刺激ASMCs，引起平滑肌的增生肥厚，參與調節哮喘細胞免疫，哮喘緩解時TNF-α又會恢復至正常水平[15]。IL-8是炎性趨化因子，能促進ASMCs增殖參與氣道重塑[16]，吸引中性粒細胞、T細胞向炎癥部位聚集，對中性粒細胞的趨化及激活作用可導致氣道反應性增高誘發加重哮喘[17-18]。IL-8還能通過影響細胞周期的重新分布來調控腫瘤細胞的增殖[19]。氣道中性粒細胞積聚是哮喘急性發作的重要標志，IL-8、TNF-α在一定程度上能反映哮喘患者炎癥的嚴重程度[20]。本研究結果表明，PDGF刺激HBSMC可使IL-8、TNF-α釋放增多，炎癥反應增強，影響細胞周期，加重細胞增殖，各給藥組均有一定抑制作用，以防風-烏梅含藥血清組與激素干預組抑制作用較強，提示防風-烏梅含藥血清能顯著降低IL-8、TNF-α的釋放量。

祝老常用防風-烏梅作為藥對配伍，用于支氣管哮喘的治療[2]。防風善于疏風勝濕止痙，《本草綱目》稱其為“除風去濕仙藥”，《藥類法象》言其能“瀉肺實……除上焦邪”；烏梅斂肺生津，可瀉風木而降沖擊，《本草綱目》用其療治久咳不已。二藥相配，相制相成，相須為用，祛邪不耗氣津，斂酸不留邪，能顯著改善哮喘氣道攣急之病理。本研究結果表明，防風-烏梅含藥血清與激素對于HBSMC增殖，IL-8、TNF-α釋放的抑制作用優于單獨使用防風血清或單獨使用烏梅血清，雖對細胞G0/G1期的抑制作用不及烏梅血清，但也表現出對細胞周期的阻滯作用，提示防風-烏梅配伍可能通過降低IL-8、TNF-α的釋放影響ASMCs細胞周期進程及增殖，進而抑制哮喘氣道重塑。

由于長期使用激素會給機體帶來一定的危害[21-23]，療效性與安全性還存在爭議[24-28]，故挖掘利用中醫藥研究藥對配伍規律不失為治療哮喘的一種新方法。至于為何細胞G0/G1期時烏梅組效果最優，其原因還需更進一步研究。