溫腎通絡(luò)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張紅巖，項(xiàng) 顆，王雪冰，徐麗娜

（吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長(zhǎng)春 130012）

溫腎通絡(luò)顆粒是由熟地黃、肉桂、補(bǔ)骨脂、炮姜、牛膝、伸筋草、白芥子、菟絲子、枳殼9味藥材經(jīng)水提、干燥、加輔料制成的中藥顆粒劑，具有溫經(jīng)通絡(luò)、補(bǔ)腎助陽(yáng)功效，可有效預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松[1-4]。為了更好的控制質(zhì)量，保證用藥安全，筆者對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，采用薄層色譜法，對(duì)制劑中各藥味進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果表明牛膝、補(bǔ)骨脂、枳殼薄層色譜鑒別特征比較明顯，重復(fù)性好，且無(wú)干擾，所以列入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；此外，采取高效液相色譜法，對(duì)顆粒中枳殼所含柚皮苷和新橙皮苷進(jìn)行含量測(cè)定，建立制劑中這2種成分的測(cè)定方法，并進(jìn)行系列的方法學(xué)考察試驗(yàn)，最終測(cè)定三批樣品中柚皮苷、新橙皮苷的含量，規(guī)定了含量限度[5-8]。通過(guò)以上相關(guān)研究，建立了溫腎通絡(luò)顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為更好控制藥品質(zhì)量奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

LC-10AT型HPLC（日本島津）；SPD-10Av型HPLC檢測(cè)器（日本島津）；LCsolution Lite色譜工作站（日本）；XS105型電子分析天平（梅特勒-托利多，十萬(wàn)分之一）；UV-2800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，250 W，頻率40 KHz）。對(duì)照品柚皮苷：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201314，96.6%，供含量測(cè)定用；對(duì)照品新橙皮苷：中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111857-201102，99.6%，供含量測(cè)定用；吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院溫腎通絡(luò)顆粒（批號(hào)：170601、170602、170603）；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 牛膝薄層色譜鑒別 取牛膝藥材20 g，研磨到細(xì)，加甲醇試劑50 mL，通過(guò)加熱回流的方法，加熱1 h后濾過(guò)，得到的濾液揮干，將其殘?jiān)诱麴s水到20 mL，通過(guò)加熱的方法將其溶解，溶解后放冷，用（飽和）正丁醇提取（3次），20 mL/次，合并3次提取液，用正丁醇飽、氨試液各50 mL洗1次，取正丁醇層液，蒸干后其殘?jiān)蛹状? mL，作為供試品溶液。另外取對(duì)照藥材4 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取樣品及對(duì)照品各5 μL，點(diǎn)于G型硅膠板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7:3:0.5:0.05），展開(kāi)后取出晾干，噴顯色劑硫酸乙醇試液（10%），105℃加熱，加熱至斑點(diǎn)清晰。樣品與對(duì)照品在色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 牛膝TLC鑒別

2.1.2 補(bǔ)骨脂薄層色譜鑒別 取補(bǔ)骨脂藥材10 g，研磨到細(xì)，先加甲醇50 mL，之后超聲30 min濾過(guò)，將濾液揮干后的殘?jiān)铀?0 mL，加熱，制冷，用水飽和正丁醇提取（3次），20 mL/次，合并正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取補(bǔ)骨脂對(duì)照藥材0.5 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法，吸取上述2種溶液，各5 μL點(diǎn)于G型薄層板上，展開(kāi)劑為正己烷-乙酸乙酯（4:1），展開(kāi)取出，噴顯色劑氫氧化鉀甲醇溶液（10%），紫外光燈下365 nm進(jìn)行檢視。樣品與對(duì)照品顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂TLC鑒別

2.1.3 枳殼薄層色譜鑒別 取枳殼藥材3 g，研磨至細(xì)，加入甲醇20 mL后超聲處理（30 min），濾過(guò)后蒸干濾液，殘?jiān)蛹状? mL后作為供試品溶液。另對(duì)照品取柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇后制成了0.5 mg/mL混合溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品和樣品上述兩種溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-水（13:6:2）的下層溶液，展開(kāi)后取出，晾干，噴顯色劑三氯化鋁乙醇溶液（3 %），在105 ℃加熱約5 min后進(jìn)行紫外光燈檢視（365 nm）。樣品與對(duì)照品顯相同顏色的斑點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖3 枳殼TLC鑒別

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB（4.6×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（33:67）；檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm。理論板數(shù)（按柚皮苷峰）不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取一定量的對(duì)照品柚皮苷和新橙皮苷，精密稱定后加甲醇，各制成80 μg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量研磨，精密稱定細(xì)粉1 g，加入具塞錐形瓶，再精密加入甲醇（50 mL），稱定重量后用超聲處理（功率250 w，頻率40 kHz）30 min，取出放冷后稱定重量，用甲醇補(bǔ)足丟失的重量后濾過(guò)，取續(xù)濾液，得到供試品。

2.2.4 方法學(xué)考察

2.2.4.1 線性范圍考察 精密稱取對(duì)照品柚皮苷、新橙皮苷，加甲醇制成各含0.295 1 mg/mL、0.311 2 mg/mL的混合溶液，精密吸取0.5 mL、1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸各個(gè)濃度對(duì)照品溶液（各10 μL），測(cè)定。橫坐標(biāo)為柚皮苷、新橙皮苷的含量，縱坐標(biāo)為峰面積，進(jìn)行繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，柚皮苷在0.148～2.656 μg，新橙皮苷在0.156～2.8 μg范圍內(nèi)，對(duì)照品的量與峰面積積分值呈良好線性關(guān)系。回歸方程：柚皮苷Y= 1933513.8X，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 8，新橙皮苷Y = 2041786.1X，相關(guān)系數(shù)r = 0.999 7。

2.2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一批供試品溶液，在0、2、4、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)得的峰面積積分值分別如下。柚皮苷：1 266 140、1 274 072、1 291 201、1 309 236、1 269 335、1 282 508、1 278 546、1 299 005，RSD% =1.17；新橙皮苷：1 115 695、1 122 845、1 134 948、1 155 020、1 118 546、1 130 110、1 122 584、1 142 613、1 130 295，RSD% = 1.18，結(jié)果表明，2種成分在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4.3 精密度考察 精密吸取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液10 μL，按照色譜條件，對(duì)同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，并測(cè)定峰面積積分值。結(jié)果，2種成分峰面積積分值分別為柚皮苷：1 229 694、1 240 047、1 249 650、1 240 109、1 233 526、1 237 798，RSD% = 1.45；新橙皮苷：1 085 590、1 091 630、1 101 921、1 094 612、1 089 216、1 092 289，RSD% = 1.42，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)同一批次溫腎通絡(luò)顆粒樣品按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，依法測(cè)定，6次測(cè)定結(jié)果分別為柚皮苷：3.052 0、3.084 6、3.073 0、3.091 1、2.990 6、2.996 2 mg/g，RSD% = 1.45；新橙皮苷：2.580 3、2.605 9、2.602 2、2.613 2、2.531 4、2.534 2、2.577 9 mg/g，RSD% = 1.42，測(cè)定結(jié)果表明，本方法重復(fù)性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量溫腎通絡(luò)顆粒6份（批號(hào)：170601，柚皮苷、新橙皮苷含量30.419 9 mg/袋、25.893 1 mg/袋），分別精密加入柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品一定量，依法測(cè)定，計(jì)算回收率，柚皮苷平均回收率為99.62%，RSD% = 1.45；新橙皮苷平均回收率為97.61%，RSD% = 2.04，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

2.2.4.6 樣品測(cè)定 依法測(cè)定3批溫腎通絡(luò)顆粒中試樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

3.1 薄層色譜鑒別 牛膝主要含有黃酮、甾酮、多糖、三萜、生物堿、有機(jī)酸等成分[9]。中國(guó)藥典2015版牛膝鑒別項(xiàng)下中用甲醇提取，蒸干加水溶解，通過(guò)上大孔樹(shù)脂柱除雜制備供試品溶液，但本品為復(fù)方顆粒成分較為復(fù)雜，所以導(dǎo)致了甲醇提取液蒸干后水溶液顏色非常深，雜質(zhì)也多，不宜選擇大孔樹(shù)脂柱除雜，故采用更為簡(jiǎn)單徹底的除雜方法，即水溶后用正丁醇提取，采用氨試液洗滌，可除去大部分色素等雜質(zhì)，制備后的供試品溶液易于點(diǎn)樣，不黏稠。同時(shí)，香草醛試液和10%硫酸乙醇試液的顯色效果進(jìn)行比較，10%硫酸乙醇試液顯色效果較好，在色譜特征中干擾雜質(zhì)斑點(diǎn)少，斑點(diǎn)清晰。在展開(kāi)劑的選擇中，通過(guò)比較三氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7：3：0.5：0.05）（《中國(guó)藥典》2015版（一部）牛膝鑒別項(xiàng)下新的展開(kāi)系統(tǒng)）和乙酸乙酯-乙醇（4：1）[10]的展開(kāi)效果研究發(fā)現(xiàn)，藥典中的展開(kāi)劑分離效果更好。

表2 3批溫腎通絡(luò)顆粒中柚皮苷、新橙皮苷含量測(cè)定結(jié)果mg/袋

補(bǔ)骨脂主要含有香豆素、黃酮、萜酚等成分[11]。在制備供試品溶液的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，首先進(jìn)行《中國(guó)藥典》2015年（一部）版補(bǔ)骨脂鑒別項(xiàng)下通過(guò)乙酸乙酯超聲提取的方法，制得的供試品溶液點(diǎn)樣困難，黏性太大，同時(shí)，薄層色譜中熒光斑點(diǎn)亮度弱，提取不完全；將采用甲醇提取，提取液蒸干加水溶解后用正丁醇提取，蒸干后加甲醇溶解，所制備的供試品溶液易于點(diǎn)樣，不黏稠。展開(kāi)劑的篩選中除《中國(guó)藥典》2015版一部補(bǔ)骨脂鑒別項(xiàng)下及文獻(xiàn)[12]采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）外，還試驗(yàn)比較了環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲苯（2：0.7：2）和石油醚-乙酸乙酯（2：3）的展開(kāi)效果，結(jié)果以中國(guó)藥典中補(bǔ)骨脂鑒別項(xiàng)下采用的正己烷-乙酸乙酯（4：1）展開(kāi)效果最好，斑點(diǎn)清晰且重現(xiàn)性良好，無(wú)陰性干擾。

3.2 含量測(cè)定

3.2.1 專屬性試驗(yàn) 在選定的色譜條件下，樣品色譜中待測(cè)成分峰前后無(wú)雜峰干擾，基本達(dá)到基線分離，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 溫腎通絡(luò)顆粒高效液相色譜圖

3.2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在色譜柱和流動(dòng)相的選擇中，試驗(yàn)比較了如下幾種色譜柱和流動(dòng)相的分離效果。色譜柱[13-14]：1）Agilent Zorbax SB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；2）Shim pack C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；3）Waters symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；4）Apollo C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相[15-22]：1）甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）；2）甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）；3）乙腈-水（20：80）；4）乙腈-水（16：84）；5）乙腈-水（17：83）；6）乙腈-0.1%磷酸溶液（31：69），結(jié)果表明，除Waters symmetry C18色譜柱外，其余3種色譜柱配合甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）流動(dòng)相，均能使樣品中柚皮苷、新橙皮苷與其他組分達(dá)到很好分離（分離度＞1.5），其中以Agilent Zorbax SB（4.6 mm×250 mm，5 μm）和甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）組合，分離效果最好，保留時(shí)間適宜，故作為本試驗(yàn)的色譜條件。

3.2.3 耐用性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品，考察在測(cè)定條件有變動(dòng)時(shí)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響程度。試驗(yàn)主要考察了不同色譜柱、不同柱溫、不同流動(dòng)相配比等變動(dòng)因素對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。

3.2.3.1 色譜柱 本實(shí)驗(yàn)選用WondSil C18、Apollo C18、Agilent ZORBAX SB-C18三個(gè)不同品牌的色譜柱進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果，測(cè)得樣品中柚皮苷含量分別為3.141 9、3.028 2、3.041 8；新橙皮苷含量分別為2.474 4、2.551 5、2.589 1 mg/g，2種成分含量無(wú)明顯變化。

3.2.3.2 柱溫 故采用ZORBAX SB-C18色譜柱，分別在20 ℃、30 ℃、35 ℃條件下測(cè)定，結(jié)果，測(cè)得樣品中柚皮苷含量分別為3.031 7、2.981 4、3.002 4 mg/g，新橙皮苷分別是2.573 0、2.538 5、2.567 9 mg/g，2種成分含量無(wú)明顯變化。

3.2.3.3 流動(dòng)相 選擇甲醇-0.1%磷酸溶液（32：68）、甲醇-0.1%磷酸溶液（33：67）、甲醇-0.1%磷酸溶液（34：66）3個(gè)比例流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果柚皮苷含量分別為3.056 5、3.050 2、3.026 7 mg/g，新橙皮苷含量分別是2.602 1、2.590 4、2.590 0 mg/g，含量無(wú)明顯變化。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在色譜條件有微小變化時(shí)，樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量無(wú)明顯變化，本方法有很好的耐用性。