紫花地丁根際菌的篩選鑒定及活性物質初步研究

姜 爽，崔健麗，樸喜航，郭寰宇，宋丹寧，李文杰，周東月，胡樹毅，郭 焱*

（1.長春中醫藥大學，長春 130117；2.吉林大學第四醫院，長春 130022）

抗生素在預防和治療由微生物引起的感染性疾病方面發揮了重要作用，但隨著耐藥菌株的出現，感染性疾病的治療愈發困難[1-2]。微生物是多種生物活性物質的重要來源，隨著研究的深入，從普通環境中分離出新的微生物及生物活性物質越來越難[3]。因此，研究者們開始把目光轉向一些新的特殊環境，研究表明，從藥用植物根際土壤中分離得到的許多微生物均具有重要的生物活性[4-7]。紫花地丁是傳統中藥之一，性寒、味微苦，有涼血消腫、清熱解毒之功效，主要用于毒蛇咬傷、丹毒腫痛、乳癰腸癰、癰腫疔瘡等癥[8]。現代藥理學研究表明，紫花地丁具有較好的抗炎、抑菌、抗病毒及抗腫瘤活性[9]。因此，本研究擬從紫花地丁根部土壤中分離、篩選出具有拮抗致病菌活性的菌株，并進行菌株的分類及抗菌活性物質分析，為進一步的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 供試土樣來源于藥用植物紫花地丁根部土壤；供試細菌大腸埃希菌Escherichia coli、金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus、表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis、銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、費氏檸檬酸桿菌Citrobacter freundii由吉林大學第四醫院檢驗科提供；供試培養基為改良高氏培養基、改良高氏液體培養基、營養肉湯及營養瓊脂，由本實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 根際菌的分離及純化 稱取10 g經自然風干并研細的土樣，加入100 mL無菌蒸餾水中，振蕩搖勻。靜置后，土壤懸液進行10倍系列稀釋，共3個濃度：1 g/mL，0.1 g/mL，0.01 g/mL。將上述3個濃度的土壤懸液分別加入改良高氏平板上，采用平板稀釋法進行根際菌的分離[10-11]。經過多次純化之后，挑取單菌落菌株，在改良高氏試管斜面上培養7 d 后，于4 ℃冰箱保存并進行編號。

1.2.2 活性菌株的篩選 采用四區劃線接種法將上述分離得到的根際菌接種在改良高氏平板上，常規方法培養7 d后，采用瓊脂塊法進行抑菌活性初篩。具體方法如下：1）將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、費氏檸檬酸桿菌分別接種至營養肉湯試管中，在37 ℃條件下培養15 h；2）隨后將菌液濃度用無菌生理鹽水調整至1.5×106CFU/mL，均勻涂布于營養瓊脂平板上，備用；3）將培養出的根際菌單菌落接種于平板上，在37℃條件下培養24 h。通過十字交叉法測量抑菌圈直徑，并篩選出抑菌活性較好的菌株。

1.2.3 活性菌株的分類鑒定 將篩選得到的活性菌株菌液送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16 s rDNA基因測序。在GenBank數據庫中將所得序列進行Blast檢索，以同源性較高的典型菌株為參比對象，再通過CLUSTAL X軟件進行供試菌株與參比菌株之間的序列相似性比較，最后用MEGA 5.0軟件構建供試菌與參比菌之間的系統進化樹。

1.2.4 活性菌株發酵液抗菌活性分析 選擇改良高氏液體培養基對活性菌株進行發酵，得活性菌株發酵液。采用紙片擴散法分析活性菌株發酵液的抗菌活性。挑取活化后的斜面培養基上的菌絲塊接種于發酵培養基中，搖瓶（28℃，150 r/min）培養7 d后，4 000 r/min離心20 min；取上清液過0.22 μm濾膜后，濾液保存在無菌管中，備用。將金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、銅綠假單胞菌、費氏檸檬酸桿菌等5株供試靶標菌按上述初篩方法培養、調整濃度，均勻涂布于營養瓊脂平板上。在無菌發酵液中放入直徑6 mm的無菌濾紙，揮干后貼于含有指示菌的平板上，在37 ℃條件下培養24 h，觀察并記錄抑菌圈直徑大小。

1.2.5 活性菌株發酵液抗菌活性物質初步分析 按上述方法制備菌株發酵液，經水飽和正丁醇萃取后，將無菌發酵液分為正丁醇層和水層。正丁醇層和水層溶液分別在37℃條件下蒸發揮干，再用無菌水溶解，過0.22 μm濾膜后得濾液，保存于無菌管中，備用。活性菌株發酵液原液、發酵液水層、發酵液正丁醇層按上述紙片擴散法進行抗菌活性測定。

2 結果

2.1 紫花地丁根際菌的分離及活性菌株篩選 根據菌種培養特征的不同從紫花地丁根部土壤中共分離出21株菌株，經過篩選，共有9株拮抗菌具有抑菌作用，其中2株菌株抑菌作用比較明顯，分別命名為Y1-7、Y1-13a。菌株Y1-7抑制金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為10 mm，抑制大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為15 mm，抑制表皮葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為14 mm，對銅綠假單胞菌、費氏檸檬酸桿菌無抑制作用。菌株Y1-13a抑制金黃色葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為9 mm，抑制大腸埃希菌的抑菌圈平均直徑為3 mm，抑制表皮葡萄球菌的抑菌圈平均直徑為12 mm，抑制銅綠假單胞菌的抑菌圈平均直徑為 17 mm，抑制費氏檸檬酸桿菌的抑菌圈平均直徑為10 mm。

2.2 活性菌株的形態鑒定 Y1-7菌落呈圓形桔紅色點狀分布，菌落表面光滑，氣生菌絲白色，基內菌絲桔紅色，邊緣規則，無水溶性色素；Y1-13a菌落呈紫色片狀分布，表面凸起，氣生菌絲白色，基內菌絲紫色，無水溶性色素。見圖1。

圖1 菌株Y1-7和Y1-13a的菌落形態

2.3 活性菌株的分類鑒定 根據16 s rDNA構建的系統發育樹分類結果表明，菌株Y1-7為Streptomyces sp.屬；菌株Y1-13a為Streptomyces californicus屬。但菌株Y1-7與Y1-13a的確切分類地位需進一步分析。見圖2。

圖2 基于16S rDNA核苷酸序列構建的菌株系統發育進化樹分析

2.4 活性菌株發酵液抗菌活性分析 活性菌株Y1-7與Y1-13a的發酵液可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌的增殖，抑菌圈直徑為10.5～15.0 mm。另外，Y1-13a對銅綠假單胞桿菌和費氏檸檬酸桿菌具有較強抑制作用，抑菌圈直徑分別為17.0 mm和10.5 mm。見圖3。

圖3 活性菌株發酵液抑制供試靶標菌

2.5 活性菌株發酵液抗菌活性物質初步分析 經正丁醇萃取后的菌株Y1-7發酵液，正丁醇層代謝物抑菌活性與發酵原液抑菌活性相同，水層代謝物無抑菌活性，由此可見，菌株Y1-7抑菌活性物質極性較小，排除糖類、蛋白質類等，可能為黃酮類或其他小分子極性物質。經正丁醇萃取后的菌株Y1-13a發酵液，正丁醇層代謝物無抑菌活性，水層代謝物抑菌活性與發酵原液抑菌活性相同，可知菌株Y1-3a抑菌活性物質極性較大，可能是糖類或蛋白質類等物質。

3 結語

自青霉素問世以來，人們不斷從微生物次級代謝產物中提取眾多抗生素[12-13]。但是，由于抗生素的長期濫用和誤用導致了細菌耐藥菌的出現[14]。近些年來，臨床上耐藥菌株種類不斷增多以及細菌耐藥性的出現均極大的限制了現有抗生素的臨床抗感染效果，因而尋找新型抗生素已是迫在眉睫[15]。根際菌大多數分布于土壤中，是與人類健康極為密切的微生物種群，亦是產生抗生素最多的一類物種[16]。研究[17-18]表明，藥用植物根部土壤中的根際菌，是一些生物活性顯著、結構新穎的天然活性產物的重要來源。因此，分離和得到這些根際菌，是進行微生物資源開發，新藥研制，解決臨床抗生素類用藥限制的重要途徑，具有重大研究意義。

本研究篩選出的2株對臨床常見耐藥菌表現出良好抑菌效果的根際菌Y1-7和Y1-13a，具有較大的潛在應用價值。但菌株Y1-7、Y1-13a的確切分類地位、活性成分等尚不明確，有待進一步深入研究。