漢防己甲素體外輔助多柔比星殺傷胃癌細胞及機制研究

石 丹馬旖旎

胃癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤之一，很多患者被確診時腫瘤已發生擴散，因此胃癌的死亡率很高[1]。手術是治療胃癌的最佳手段，但對于已經發生腫瘤擴散的患者而言，系統性化療是不可或缺的治療方案[2]。多柔比星又稱為阿霉素，是一種抗腫瘤抗生素，它能嵌入到腫瘤細胞的DNA中，從而抑制RNA和DNA的合成并誘導細胞進入凋亡程序。臨床上，多柔比星被廣泛用于胃癌、肝癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤的治療，然而多柔比星的毒副反應尤其是心臟毒性較大，因此尋找合適的輔助治療藥物提高胃癌細胞對多柔比星的敏感性以降低多柔比星的使用劑量具有十分重要的意義[3-5]。本研究探討中藥活性成分漢防己甲素是否能輔助多柔比星殺傷胃癌細胞并研究其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養 人胃癌細胞系MGC-803購于中科院上海細胞庫（批號TCHu84），培養在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37°C恒溫培養箱中培養并通入5%CO2。

1.2 試 劑 多柔比星（批號D1515）、漢防己甲素（批號 T2695）、噻唑藍（MTT，批號 M2128）和凋亡檢測試劑盒（批號APOAF）購于德國Sigma-Aldrich。小窩蛋白-1（caveolin-1，批號#3267）、蛋白激酶B（AKT，批號 #4691）、磷酸化 AKT（批號 #4060）、B 淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2）相關細胞死亡激動子（Bad，批號#9268）、磷酸化 Bad（批號 #5284）、B 淋巴細胞瘤-2蛋白（Bcl-2，批號#4223）、大分子B淋巴細胞瘤蛋白（Bcl-xl，批號#2764）、半胱天冬酶-9（caspase-9，批號 #9502）、半胱天冬酶-3（caspase-3，批號#9665）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號#5174）抗體購于美國Cell Signaling。增強化學發光底物顯色試劑盒（ECL，批號32106）購于美國Pierce。脂質體2000（Lipofectamine 2000，批號11668019）購于美國Invitrogen。蛋白G免疫共沉淀瓊脂糖珠（批號sc-500778）購于美國Santa Cruz。

1.3 caveolin-1真核表達載體的構建及轉染 首先通過分子克隆技術將caveolin-1基因的開放閱讀框架序列與pcDNA3.1連接后構建成caveolin-1重組質粒。將MGC-803細胞接種在6孔板上孵育過夜，使其貼壁。將終濃度為2μg/mL的caveolin-1重組質粒用Lipofectamine 2000進行包裹后將其加入到無血清培養基進行混合。移去原6孔板中的培養基，并將上述含caveolin-1重組質粒的無血清培養基加入到6孔板中，孵育6h后移去無血清培養基，并加入新鮮的含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養24h。收集細胞用于后續實驗。對照細胞為Lipofectamine 2000（含空質粒，終濃度為 2μg/mL）孵育 6h。

1.4 相對細胞活力檢測 將MGC-803細胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜，使之貼壁進行分組實驗。實驗分為對照組（空質粒轉染但不加藥物處理）、漢防己甲素組（2μg/mL漢防己甲素處理），多柔比星組（1μg/mL多柔比星處理）、漢防己甲素+多柔比星組（2μg/mL漢防己甲素+1μg/mL多柔比星聯合處理）和漢防己甲素+多柔比星+caveolin-1質粒組（MGC-803細胞用caveolin-1質粒轉染并用2μg/mL漢防己甲素+1μg/mL多柔比星聯合處理）。細胞培養48h后在每個培養孔中加入0.1mg MTT并將細胞繼續置于37°C恒溫培養箱中培養4h。小心吸走孔內培養基，加入100μL二甲亞砜，充分震蕩混勻后在570nm波長下測定OD值。各組相對細胞活力=藥物處理組OD值/對照組OD值。

1.5 免疫共沉淀 按1.4所述進行分組處理MGC-803細胞，之后對MGC-803細胞進行計數，取2×106的各組細胞用免疫沉淀緩沖液進行裂解，緩沖液的成分如下：50mmol/L Tris-HCl（pH7.4），1%NP-40細胞裂解液，150mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA。MGC-803細胞在裂解液下處理15min后，12 000rpm離心10min，收取上清液。將上清液分成等量兩份，一份用作內參，另一份進行免疫共沉淀，在其中加入Bad抗體孵育過夜，之后加入蛋白G瓊脂糖珠孵育2h。孵育完成后1200rpm離心5min，將瓊脂糖珠離心至管底，之后將上清液小心吸去，瓊脂糖珠用免疫沉淀緩沖液洗滌2次后加入Western blot上樣緩沖液，沸水浴煮5min后備用，用于檢測與Bad結合的Bcl-2和Bcl-xl蛋白。

1.6 Western blot試驗 用蛋白提取液提取MGC-803細胞中的總蛋白質。將等量的總蛋白質和1.5下所得樣品用10%SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉方法將蛋白質從分離膠上轉到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉對PVDF進行封閉孵育2h，之后再將PVDF膜用caveolin-1、AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化 Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-9、caspase-3和GAPDH抗體進行孵育過夜。一抗孵育完畢后的PVDF膜再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發光。

1.7 細胞凋亡試驗 按1.4所述分組處理MGC-803細胞，之后對MGC-803細胞進行計數，取2×106的各組細胞按照凋亡檢測試劑盒說明書步驟用Annexin-V和碘化丙啶（PI）對細胞進行染色孵育20min，之后用生理鹽水洗滌2次，采用流式細胞術檢測MGC-803細胞的凋亡，凋亡率用Annexin-V陽性細胞數占總細胞數的百分比表示。

1.8 統計學方法 所有實驗重復3次，應用SPSS16.0軟件進行數據統計分析，計量資料用均數±標準差（±s） 表示。多組間均數的比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），統計檢驗方法行Bonferroni校正，進行多組間均數的兩兩比較，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢防己甲素對多柔比星輔助抗胃癌活性 MTT實驗結果顯示漢防己甲素+多柔比星組MGC-803相對細胞活力顯著低于漢防己甲素組和多柔比星組（P＜0.05），凋亡率較漢防己甲素組和多柔比星組高，表明漢防己甲素對多柔比星有輔助抗胃癌活性。見表1。

表1 各組MGC-803細胞相對細胞活力和凋亡率比較（±s）

表1 各組MGC-803細胞相對細胞活力和凋亡率比較（±s）

注：與多柔比星組比較，*P＜0.05；與漢防己甲素組比較，▲P＜0.05；與漢防己甲素+多柔比星組比較，△P＜0.05

組別對照組漢防己甲素組多柔比星組漢防己甲素+多柔比星組漢防己甲素+多柔比星+caveolin-1質粒組孔數3 3 3 3 3相對細胞活力1.00±0.07 0.89±0.06 0.79±0.06 0.34±0.03*▲0.71±0.06△凋亡率（%）1.91±0.22 6.92±0.61 12.23±1.13 40.32±3.51*▲15.94±1.22△

2.2 MGC-803細胞caveolin-1可能是漢防己甲素的直接靶點 Western blot實驗結果顯示，漢防己甲素組、漢防己甲素+多柔比星組MGC-803細胞caveolin-1表達水平、AKT和Bad磷酸化水平均明顯低于對照組、多柔比星組（圖1），表明caveolin-1是漢防己甲素的直接作用靶點。另外，轉染caveolin-1表達質粒能使MGC-803細胞caveolin-1發生強制過表達，廢除漢防己甲素對caveolin-1的抑制（圖1）。MTT和流式細胞實驗結果顯示，漢防己甲素+多柔比星+caveolin-1質粒組MGC-803的相對細胞活力顯著高于漢防己甲素+多柔比星組，而其細胞凋亡率顯著低于漢防己甲素+多柔比星組（P＜0.05）（表 1）。這些結果表明漢防己甲素抑制MGC-803細胞caveolin-1表達從而增強多柔比星的抗胃癌活性。

2.3 漢防己甲素通過caveolin-1/AKT/Bad途徑促進多柔比星誘導的凋亡 免疫共沉淀與Western blot實驗結果顯示，漢防己甲素聯合多柔比星組MGC-803細胞Bad與Bcl-xl及Bcl-2結合水平、caspase-9和caspase-3活化水平均高于多柔比星組（圖2）。同時，流式細胞實驗結果顯示，漢防己甲素+多柔比星組MGC-803凋亡率顯著高于多柔比星組（P＜0.05）（表 1）。然而，漢防己甲素+多柔比星組 MGC-803細胞Bad與Bcl-xl及Bcl-2結合水平、caspase-9和caspase-3活化水平及凋亡水平均顯著低于漢防己甲素+多柔比星+caveolin-1質粒組（圖2）。這些結果表明在胃癌細胞中，漢防己甲素可能通過caveolin-1/AKT/Bad途徑促進多柔比星誘導的凋亡。

圖1 漢防己甲素、多柔比星和caveolin-1質粒處理對MGC-803細胞caveolin-1表達水平及AKT和Bad磷酸化水平的影響

3 討論

多柔比星是臨床上治療胃癌的重要化療藥物，然而大劑量多柔比星的心臟毒性較大，因此提高胃癌細胞對多柔比星的敏感性以降低多柔比星的使用劑量是目前亟待解決的課題。研究[6-7]發現一些中藥活性成分具有一定的抗腫瘤能力，并且聯用這些中藥活性成分能有效提高化療藥物的療效。漢防己甲素又名粉防己堿、漢防己堿，是一種提取自粉防己根的雙芐基異喹啉生物堿，臨床上主要用于關節炎、心律失常、炎癥等疾病的治療。近期研究[8-9]發現，漢防己甲素還具有一定的抗腫瘤活性，如能抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移，又能通過ROS/Notch1信號通路誘導白血病細胞的自噬和分化。本研究發現，盡管漢防己甲素單獨處理對胃癌細胞系的殺傷活性較弱，但其能明顯增強多柔比星的抗胃癌活性（P＜0.05），表明漢防己甲素可以作為輔助治療藥物增強胃癌細胞對多柔比星的敏感性，提高其療效。

圖2 漢防己甲素通過caveolin-1/AKT/Bad途徑促進多柔比星誘導的凋亡（A：漢防己甲素、多柔比星和caveolin-1質粒處理對MGC-803細胞中Bad與Bcl-2及Bcl-xl相互作用的影響；B：漢防己甲素、多柔比星和caveolin-1質粒處理對MGC-803細胞中caspase-9、caspase-3活化水平的影響）

caveolin-1是構成細胞膜小窩的重要結構蛋白，對細胞膜的分子轉運、細胞黏附和信號轉導起重要作用，能促進腫瘤細胞的生長、存活和轉移[10-13]。研究[10-13]表明，caveolin-1在腫瘤細胞中發揮抗凋亡活性，并且caveolin-1和腫瘤細胞的化療抵抗有關，多藥耐藥的肺癌、胰腺癌和乳腺癌細胞的caveolin-1都被發現過表達，并且caveolin-1的過表達還和腫瘤患者的不良預后有關，因此，caveolin-1可作為腫瘤治療的潛在靶點。在caveolin-1的下游通路中，AKT的激活是caveolin-1發揮腫瘤促進作用的重要步驟[14]。Bad是Bcl-2促凋亡蛋白家族成員，是AKT激酶的底物。非磷酸化的Bad能通過與抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl結合，使之失活從而發揮促凋亡作用。然而，當Bad被AKT途徑磷酸化后，磷酸化的Bad會從其與Bcl-2或Bcl-xl形成的異二聚體中分離出來，并與14-3-3支架蛋白結合從而失去促凋亡活性[15-16]。本研究結果表明，漢防己甲素能明顯抑制胃癌細胞caveolin-1蛋白表達水平，從而抑制胃癌細胞AKT磷酸化通路，使Bad蛋白保持在非磷酸化活性狀態中，從而抑制Bcl-2和Bcl-xl的抗凋亡活性，提高胃癌細胞對多柔比星誘導的凋亡通路的敏感性，表現為凋亡執行蛋白caspase-9和caspase-3的顯著活化，誘導胃癌細胞發生凋亡性死亡。

綜上所述，漢防己甲素可能通過caveolin-1/AKT/Bad途徑增強多柔比星對胃癌細胞的凋亡誘導活性。