復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)胎兒絨毛染色體微陣列芯片327例分析

程丹 楊菁 李潔 張營(yíng) 陳嬌

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（RSA）是指女性與同一性伴侶發(fā)生的2次或2次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)生率約為1%～5%[1]。RSA一直是妊娠相關(guān)疾病中攻而不克的難題，其中約60%的患者自然流產(chǎn)原因不明，稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）。既往研究報(bào)道半數(shù)以上的自然流產(chǎn)，尤其是孕12周前的早期妊娠流產(chǎn)，為胎兒染色體異常導(dǎo)致[2]。目前，胎兒染色體異常的類型及其產(chǎn)生的原因相關(guān)研究較少。近年來，針對(duì)流產(chǎn)絨毛組織開展的染色體微陣列分析（CMA）被廣泛應(yīng)用于臨床[3]。CMA對(duì)探尋RSA病因和對(duì)后續(xù)生殖干預(yù)的價(jià)值一直是爭(zhēng)論的焦點(diǎn)問題。為此，本研究收集了因RSA行絨毛CMA的327例患者，探討流產(chǎn)胎兒染色體核型與母體狀況和RSA的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選取2016年1～12月因RSA在我科就診，并要求行絨毛CMA的患者為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①既往曾發(fā)生2次或以上的孕12周前自然流產(chǎn)；②本次超聲確診胚胎停育或難免流產(chǎn)；③停經(jīng)45～80 d；④要求行絨毛CMA芯片檢測(cè)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①夫妻雙方染色體核型異常；②孕期有明確的感染性疾病病史；③女方有嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病；④合并子宮肌瘤、子宮畸形等子宮異常患者。本研究經(jīng)武漢大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署臨床研究知情同意書。

二、方 法

1.主要試劑及儀器

Agilent寡核苷酸基因組雜交（CGH）試劑盒，北京博爾城科技全基因組DNA提取試劑盒，QIA?GEN自動(dòng)DNA提取儀，Thermo CO2培養(yǎng)箱，Olym?pus CX31生物顯微鏡，Cyto Scan HD基因芯片試劑盒及Affymetrix基因芯片雜交儀，Clontech DNA擴(kuò)增試劑盒。

2.流產(chǎn)胎兒絨毛基因組DNA提取

清宮術(shù)后征得患者及其家屬書面同意，留取約直徑2 cm流產(chǎn)胎兒絨毛組織，用無菌生理鹽水漂洗3～5次，48 h內(nèi)用全基因組DNA提取試劑盒提取DNA，所取DNA經(jīng)檢測(cè)濃度與純度符合標(biāo)準(zhǔn)后置于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r(shí)將母體外周血2 ml置于EDTA抗凝管，4℃保存，使用自動(dòng)DNA提取儀提取DNA，與絨毛提取DNA進(jìn)行比對(duì)以排除母體污染。

3.流產(chǎn)胎兒絨毛CMA檢測(cè)

采用美國(guó)Affymetric公司的CytoScanHD基因芯片，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作，將提取的絨毛基因組DNA，稀釋后取5μl加入NspⅠ酶消化后，末端補(bǔ)齊后連接上共同引物，PCR擴(kuò)增純化，產(chǎn)物通過片段化酶片段化，連接生物素標(biāo)記，雜交混勻變性后加載于芯片上，置于雜交儀中50℃雜交16～18 h，沖洗、染色后掃描，獲取數(shù)據(jù)用于結(jié)果分析。

4.數(shù)據(jù)分析

CMA檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用美國(guó)Affymatrix公司配套的染色體分析套件（Chas）3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)歸化和結(jié)果分析。對(duì)在疾病數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)道的染色體變異，歸為致病性的變異；在正常的染色體多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)中有相符合的染色體變異，歸為正常染色體多態(tài)性。同時(shí)收集患者年齡、孕產(chǎn)史、BMI等資料，根據(jù)患者的年齡分為＜35歲組和≥35歲組，根據(jù)患者BMI分為＜18.5 kg/m2組、18.5～24.9 kg/m2組和＞24.9 kg/m2組，分別比較不同年齡組及不同BMI組患者的流產(chǎn)胎兒染色體異常率[4]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)后，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（上、下四分位數(shù)）表示；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、327例RSA患者的臨床資料分析

327例RSA患者的年齡19（21，44）歲，自然流產(chǎn)3（2，6）次，有正常妊娠史66例（20.2%），其中45例有早期妊娠人工流產(chǎn)史，有正常分娩史17例，既有人工流產(chǎn)史也有正常分娩史并出現(xiàn)2次以上的自然流產(chǎn)4例。

二、CMA結(jié)果分析

327例流產(chǎn)胎兒絨毛CMA結(jié)果中，正常169例（51.7%），異常158例（48.3%）。158例異常者中，染色體數(shù)目異常占84.8%，結(jié)構(gòu)異常占15.2%。染色體數(shù)目異常中最多見為三體綜合征，其次為X染色單體。染色體結(jié)構(gòu)異常中多見染色體微重復(fù)和微缺失，見表1。

表1 158例異常胎兒染色體的類型分布

三、不同年齡、BMI的RSA患者間胎兒染色體異常率及分型比較

年齡≥35歲的RSA患者胎兒染色體異常率高于年齡＜35歲者（P＜0.01），2組異常染色體分型間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同BMI患者間胎兒染色體異常率及分型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

表2 不同年齡、BMI的RSA患者間胎兒染色體異常率及分型比較 例（%）

討 論

RSA是難治性的生育障礙，發(fā)病率為1%～5%。偶發(fā)性自然流產(chǎn)可看作在配子形成及胚胎發(fā)育過程出現(xiàn)的隨機(jī)錯(cuò)誤事件，屬自然淘汰過程，但2次以上自然流產(chǎn)者的再次妊娠流產(chǎn)發(fā)生率上升3倍，3次后再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)80%[5]。RSA對(duì)育齡婦女造成嚴(yán)重的身心傷害，大大增加患者心理和精神負(fù)擔(dān)[6]。

RSA的病因復(fù)雜，半數(shù)以上的流產(chǎn)是由于胚胎或胎兒的染色體異常，進(jìn)行染色體檢查非常必要[7]。2%～5%的夫婦染色體正常，但妊娠后可能產(chǎn)生一個(gè)染色體重排的不平衡胚胎，因此雙親染色體核型分析并不能取代胎兒染色體核型分析[8]。對(duì)流產(chǎn)胎兒行染色體檢查可以判斷流產(chǎn)原因是否為胎兒染色體異常，對(duì)RSA夫婦的遺傳咨詢和指導(dǎo)再次妊娠有重要意義。

Gonzales等[9]分析了流產(chǎn)胚胎染色體異常類型的頻率，結(jié)果顯示48%的早期自然流產(chǎn)胚胎染色體異常，Huang等[10]研究報(bào)道流產(chǎn)胚胎中染色體非整倍體的發(fā)生率是34.7%。本組資料中胎兒異常比例為48.3%，與既往報(bào)道相近。

自然流產(chǎn)中的染色體異常80%以上為數(shù)目異常，尤其以非整倍體的發(fā)生最多見，包括三體、單體及多倍體等[11]。染色體的非整倍體被認(rèn)為是造成人類胚胎這種低著床率和早期丟失的一個(gè)重要原因。本研究也證實(shí)了這一現(xiàn)象，染色體數(shù)目異常占84.8%，尤其是各種三體綜合征比較多見。三體通常是母體減數(shù)分裂中同源染色體不分離，導(dǎo)致子細(xì)胞中染色體的重復(fù)。本研究中，染色體三體發(fā)生率從高至低依次為18、16、21、22、15號(hào)，個(gè)別次序不同可能是樣本量不足的偏倚。X連鎖染色體滅活與不明原因RSA有關(guān)。胚胎X性染色單體通常是卵子或精子受精過程出現(xiàn)分離錯(cuò)誤導(dǎo)致的[12]。染色體核型為（45，XO）即Turner綜合征，是僅次于三體綜合征的一類染色體異常，本研究中其發(fā)生率為16.5%。常染色體出現(xiàn)單體的情況較少，本研究中僅2例21單體，發(fā)生率為1.3%。另一類比較常見的染色體數(shù)目異常為多倍體，如三倍體或四倍體，本研究中的發(fā)生率為10.8%。三倍體通常是由于雙精入卵或卵子在母體減數(shù)分裂過程中不分離而直接受精導(dǎo)致，四倍體可能是由于受精卵有絲分裂不分離導(dǎo)致。因?yàn)榉钦扼w流產(chǎn)大多偶然發(fā)生，患者預(yù)后通常較好，在隨后的妊娠中可能獲得正常胎兒。反復(fù)發(fā)生的胎兒異常還可通過胚胎植入前遺傳學(xué)篩查（PGS）篩選正常胚胎，避免反復(fù)流產(chǎn)所致的精神和身體創(chuàng)傷[13]。

胚胎單純的染色體數(shù)目異常，夫婦再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)一般相對(duì)較低，而染色體結(jié)構(gòu)異常胚胎，往往提示夫婦染色體異常攜帶可能較大，再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也較高[14?15]。本研究顯示，染色體結(jié)構(gòu)異常24例，這種微變異常規(guī)染色體核型分析易漏診，而夫婦可能攜帶有類似片段異常但未出現(xiàn)相關(guān)表型或癥狀較輕。

孕婦年齡也是胚胎染色體異常的重要因素，隨著年齡增加，染色體發(fā)生異常風(fēng)險(xiǎn)增加，尤其三體綜合征，可能由高齡孕婦卵母細(xì)胞暴露于有害環(huán)境機(jī)會(huì)增加，以及卵子老化引起染色體減數(shù)分裂不分離現(xiàn)象導(dǎo)致[16]。本研究顯示，年齡≥35歲的RSA患者胎兒染色體異常率高于年齡＜35歲者，說明女性在35歲以后開始出現(xiàn)明顯的卵巢老化與卵母細(xì)胞分裂異常。本研究亦通過對(duì)患者BMI進(jìn)行分層分析，結(jié)果顯示BMI＜18.5、18.5～24.9、＞24.9 kg/m2者的胎兒染色體異常率組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能跟樣本例數(shù)較少有關(guān)，值得臨床進(jìn)一步關(guān)注。

絨毛細(xì)胞是胚胎外胚層細(xì)胞，具有與胎兒組織相同的遺傳性狀，利用絨毛細(xì)胞檢測(cè)胎兒染色體是細(xì)胞遺傳學(xué)研究的主要方法，常用的方法包括G顯帶染色體核型分析與熒光原位雜交（FISH）等。其中G顯帶是比較經(jīng)典傳統(tǒng)的方法，費(fèi)用低廉，可以準(zhǔn)確檢測(cè)流產(chǎn)組織的染色體核型，缺點(diǎn)在于需要對(duì)所獲得的胎兒絨毛進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，無菌要求高，容易污染，尤其是胚胎停育時(shí)間較長(zhǎng)的流產(chǎn)物，絨毛中活細(xì)胞數(shù)少，培養(yǎng)失敗比例高。G顯帶染色體核型分析的局限性還在于不能分辨長(zhǎng)度在10 Mb以下片斷的缺失、重復(fù)或易位，而且對(duì)染色體亞端粒區(qū)域異常診斷率較低，染色體異常漏診率可高達(dá)10%[17]。FISH通過特異性的探針能夠快速診斷染色體數(shù)目異常，可大大提高診斷精度，而且對(duì)標(biāo)本要求較低，不僅可以檢測(cè)處于細(xì)胞分裂中期的活細(xì)胞，對(duì)于細(xì)胞間期的無活性或污染的標(biāo)本也能檢測(cè)，也無需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。但FISH的缺點(diǎn)是只能利用特異的探針，檢測(cè)特定的5～12條染色體，不能覆蓋全基因組，尤其對(duì)背景未知的基因引發(fā)的疾病無法檢測(cè)。其他方法包括基于毛細(xì)管電泳檢測(cè)的熒光定量PCR或多重連接依賴探針擴(kuò)增等，這些方法僅能針對(duì)一定數(shù)目的片段進(jìn)行分析，存在局限性[18]。

近年發(fā)展起來的CMA技術(shù)是通過對(duì)所有染色體中的基因進(jìn)行掃描[19?20]。本研究采用Affymetrix公司的Cyto Scan HD芯片，在高密度優(yōu)化的單核苷酸多態(tài)性（SNP）探針基因分型芯片基礎(chǔ)上加入了拷貝數(shù)目變異（CNV）探針，同時(shí)檢測(cè)片段的SNP、CNV及雜合性缺失（LOH），不僅能在整個(gè)基因組范圍內(nèi)準(zhǔn)確地檢測(cè)出50 kb以上的染色體不平衡，分析嵌合型、三倍體等，還能檢測(cè)出額外的5%亞微觀染色體變異與失衡[21]。與傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析和FISH檢測(cè)相比，CMA技術(shù)不僅具有高通量、高分辨率和高自動(dòng)化檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)，還能克服母源污染和培養(yǎng)失敗，提高異常核型的檢出率，已被我國(guó)兒科協(xié)會(huì)和產(chǎn)前診斷協(xié)會(huì)分別推薦用于兒科遺傳病及產(chǎn)前診斷。值得關(guān)注的是，CMA也存在一定的局限性，它無法檢測(cè)到染色體平衡性重排，也不能檢出所有的CNV，如1、9、16及Y染色體次縊痕區(qū)域和D組、E組染色體短臂等區(qū)域，對(duì)于低于檢測(cè)分辨率的CNV、單基因遺傳病的點(diǎn)突變異常、基因表達(dá)異常和甲基化異常也無法檢出[22]。把CMA與流式細(xì)胞儀、小隨體基因分型或與分裂中期FISH相結(jié)合，可以彌補(bǔ)CMA技術(shù)缺陷，但是費(fèi)用較高。

Lo等[23]報(bào)道，在常規(guī)染色體核型分析正常，但超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的病例中病理性CNV檢出率為6.5%，高齡孕婦CMA陽性率是1.0%。本研究中有3例檢出微缺失，2例檢出微變異，占全部異常病例的5.2%。目前對(duì)亞微觀染色體變異與失衡是否是導(dǎo)致流產(chǎn)直接原因的觀點(diǎn)并不一致。有學(xué)者認(rèn)為，這種染色體亞微觀變異為單純多態(tài)性，在正常人群中也可發(fā)生。多數(shù)研究認(rèn)為，雖然染色體微失衡并不直接改變整個(gè)基因編碼區(qū)，但可能改變涉及區(qū)域內(nèi)覆蓋的基因結(jié)構(gòu)，影響基因的表達(dá)[24]。染色體微變異部分還可造成同源染色體配對(duì)困難，遺傳物質(zhì)重復(fù)或缺少，從而影響細(xì)胞分裂，可能是妊娠失敗的原因。

染色體數(shù)目異常相關(guān)的自然流產(chǎn)，與父母雙方染色體無關(guān)，再發(fā)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低；染色體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的流產(chǎn)，可能與父母染色體異常攜帶相關(guān)，其再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)也較高[25]。因此對(duì)于此類型的流產(chǎn)，雖然父母雙方常規(guī)染色體核型分析正常，仍建議診斷異常片段進(jìn)行更高精度的染色體結(jié)構(gòu)分析，以評(píng)價(jià)對(duì)后續(xù)妊娠可能的影響。本研究顯示，大部分染色體異常為數(shù)目異常，327例URSA患者中結(jié)構(gòu)異常僅24例，約15.2%，主要包括染色體的微重復(fù)、微缺失和微變異，這些異常可能與胚胎停育相關(guān)，夫婦可能攜帶有類似片段異常，由于其遺傳外顯率不全、表現(xiàn)度差異及性連鎖隱性遺傳等因素影響而未出現(xiàn)相關(guān)表型或癥狀較輕。

綜上所述，RSA患者的胎兒染色體異常率高，對(duì)胎兒進(jìn)行染色體分析對(duì)后續(xù)的妊娠指導(dǎo)至關(guān)重要，胎兒染色體異常大多數(shù)為數(shù)目異常，流產(chǎn)絨毛組織的CMV具有獨(dú)特的高分辨率、高靈敏度和特異度，并且能夠精確定位，CMV在染色體病的基因型?表型關(guān)系診斷具有較高的應(yīng)用價(jià)值。