左、右半結腸癌KRAS基因和VEGF表達水平及其臨床意義

鄒勁林,牛 斌,莫湘瓊,凌志東

(中山大學附屬第五醫院胃腸外科，廣東珠海 519000)

結腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，1990年BUFILL等[1]首次較為系統的從流行病學、病理學、細胞遺傳學、分子特征、致癌機制等方面闡述了左半結腸癌(LCC)與右半結腸癌(RCC)的差異，提出LCC、RCC是兩種疾病。原發腫瘤的部位對結直腸癌預后的影響是其研究的熱點之一,但是仍存在爭議[2]。肝轉移是結腸癌重要致死性因素之一，與多種因素有關，其中血管內皮生長因子(VEGF)在惡性腫瘤發生與發展中具有重要促進作用。鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)對人類癌癥影響很大。KRAS和神經母細胞瘤癌基因(NRAS)是Ras基因家族中的重要基因，是表皮生長因子受體(EGFR)信號轉導通路中重要的介導因子，控制細胞增殖和存活。作者通過回顧性分析本院收治的結腸癌患者的臨床資料， 對比LCC、RCC的主要臨床病理特征與KRAS基因突變率和VEGF表達差異性及其對肝轉影響情況。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2004年1月至2011年12月本院收治的結腸癌患者218例，其中男123例，女95例，年齡29～83歲，平均(47.40±5.60)歲。臨床、病理、影像、治療、隨訪資料完整，隨訪時間5年以上。按照原發腫瘤部位分為LCC組和RCC組，所有患者術后輔助治療參照《NCCN結直腸癌臨床實踐指南》，肝轉移患者的治療參照文獻[3]。兩組患者臨床相關資料比較，見表1。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 人類KRAS基因突變檢測試劑盒及石蠟包埋組織DNA提取試劑盒購自廈門艾德生物醫藥科技有限公司；微量紫外分光光度計購自美國Thermofisher sci-entific公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國BIO-RAD公司。

1.2.2KRAS基因突變檢測方法 (1)DNA提取：挑選腫瘤組織相對較多的蠟塊切10張4 μm厚切片，脫蠟處理，再切1張2.5 μm厚切片進行HE染色，據HE染色結果，提取DNA。(2)基因突變檢測：嚴格按照艾德DNA提取試劑盒的說明進行操作。

1.2.3免疫組織化學法檢測VEGF表達 將已知陽性切片作為陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.3統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行數據分析，兩樣本率進行χ2檢驗，樣本小于40的采用Fisher確切概率法，Mann-Whitney秩和檢驗比較基因突變與結腸癌及其肝轉移灶臨床病理特征的關系，采用Logisitie多因素回歸分析影響肝轉移發生的危險因素，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1LCC及RCC的臨床病理特點 RCC發病年齡超過60歲、低分化、原發腫瘤大于5 cm、脈管侵犯、神經侵犯、Ⅳ期病例數、初診時合并肝轉移等構成比均高于LCC(P<0.05),但初診時合并腸梗阻和可切除肝轉移比例LCC高于RCC(P<0.05),見表1。

表1 兩組患者臨床相關資料比較[n(%)]

2.2LCC及RCC組的KRAS基因突變和VEGF陽性表達比較 LCC、RCC的KRAS基因突變率分別為29.41%(30/102)、42.24%(49/116)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。初診時合并神經周圍侵犯、肝轉移的LCC、RCC基因突變率比較，差異無統計學意義(P>0.05)；肝轉移可切除和不可切除基因突變率組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，但LCC和RCC可切除與不可切除組內基因突變率比較，差異均有統計學意義(66.67%vs.87.50%，50.00%vs.95.00%，χ2=9.55、16.71，P<0.05)。其他項目KRAS基因突變率組間比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；KRAS基因突變率在年齡、性別和分化程度方面組內比較差異均無統計學意義(P>0.05)。LCC、RCC組患者的VEGF陽性表達率分別為64.71%(66/102)、80.17%(93/116)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.01)。LCC和RCC組間大于60歲、原發腫瘤大于5 cm、合并脈管侵犯、Ⅳ期、肝轉移和腸梗阻陽性率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。分化程度和合并神經侵犯組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 LC和RC主要臨床病理因子構成比、KRAS突變率及VEGF陽性率(%)

2.3影響LCC及RCC肝轉移的因素 進行Logistic回歸分析結果顯示，腫瘤部位、大小、分化程度、脈管侵犯、KRAS基因突變率和VEGF陽性表達率均是結腸癌肝轉移的危險因素。

2.4兩組患者隨訪結果比較 兩組患者隨訪時間均大于或等于60個月， 7例失訪，60個月隨訪率為96.79%(211/218)。LCC、RCC組患者總5年生存率分別為71.61%(73/102)、59.53%(69/116)，兩組比較差異有統計學意義 (P<0.05)。

3 討 論

在過去較長時期臨床上一直將LCC、RCC視為同一種疾病進行治療。自從BUFILL等[1]提出二者是兩種不同疾病并基于結腸不同胚胎起源提出左、右半結腸之分，認為LCC、RCC應被視為不同類型的兩種疾病[4]。國內外不少學者從不同角度研究二者的生物學特征的差異性。流行病學分析顯示，世界范圍內RCC發病率呈升高趨勢，LCC發病率呈下降趨勢[5]。臨床病理及預后方面二者存在明顯差異性，RCC中晚期預后比LCC更差[6-9]。

本研究聯合檢測KRAS和VEGF兩個與腫瘤發生、發展和轉移密切相關的基因，結合臨床病理特點，旨在從臨床、病理、基因多個層面探討LCC、RCC的生物學特性差異性及其原因。本研究結果顯示，>60歲患者RCC與LCC比例高；RCC原發腫瘤較左側大，低分化、脈管侵犯、神經侵犯及合并肝轉移比例均較LCC高(P<0.05)。LCC、RCC組患者總5年生存率分別為71.61%、59.53%，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。在臨床、病理及預后方面二者存在差異性與上述文獻報道相似。推測出現上述差異性的解剖因素：右半結腸由腸系膜上動脈供血，經腸系膜上靜脈回流入肝。右半結腸管徑較大，管腔壁較薄故而彈性好，其內容物水分較多。左半結腸則由腸系膜下動脈供血，經腸系膜下靜脈回流入肝。左半結腸因腸道狹小且壁厚，水分逐漸被大部分吸收，糞便形成。右半結腸動脈弓血供相對左半結腸豐富，有利于腫瘤構建自身豐富的微循環，因此腫瘤生長較快，生長的空間相對較大，所以臨床發現相對較晚。由于右半結腸靜脈叢豐富且回流距離肝臟相對較近，更容易出現肝轉移，因此，初診時RCC發現較晚，合并肝轉移比例相對較高，從而導致預后相對較差。

在基因層面，微衛星不穩定性(MSI)是DNA錯構修復基因突變或失活。多見于LCC，啟動區域CpG島甲基化導致的遺傳改變多見于RCC[10-11]。曾亮等[12]研究發現LCC與LCC癌旁的差異基因共有389個，而RCC和RCC癌旁的差異基因共有103個，這些基因可能與結腸癌的發生和發展有關，進一步從基因水平揭示LCC、RCC的生物學特性不同。KRAS基因是EGFR信號通路上的重要靶點，抗EGFR單克隆抗體治療的療效與其密切相關，只有野生型方可獲益[13]。KRAS基因結直腸癌中突變率較高，與腫瘤發生、發展有關[14]。RUI等[15]認為KRAS基因與腫瘤分化程度和部位等無關。然而FRIEDRICH等[16]研究提示,KRAS基因的突變與RCC高分化程度、黏液化成分及低淋巴結轉移率相關。VEGF在腫瘤形成、生長和轉移中起重要作用，其表達受許多信號通路的調節，同時取決于細胞的環境[17]。林冰等[18]認為VEGF在轉移性結腸癌中呈現高表達，與分期分化程度無關。

本研究顯示，RCC的KRAS基因突變率較LCC高(P<0.01)。初診時合并神經周圍侵犯及肝轉移的LCC、RCC患者KRAS基因突變率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，其余研究因子組間比較均存在明顯差異，RCC組高于LCC組(P<0.05)。KRAS基因突變與性別、腫瘤部位、分化程度、分期、脈管侵犯等因素有關。RCC的VEGF陽性表達率、原發腫瘤大于5 cm、合并脈管侵犯和肝轉移陽性率均高于LCC(P<0.05)，提示該基因可能與結腸癌肝轉移有一定關系，RCC更容易發生肝轉移，可能是RCC初診時肝轉移率較高原因之一。KRAS基因第13位密碼子突變與結直腸癌發生同時性肝轉移及局部轉移相關，在結腸癌病理過程中，腸黏膜上形成大量新生血管，VEGF因其具有促進細胞增殖、促進血管生成的功能，在腫瘤的發生、發展及轉移中具有重要作用[19-20]，從而可以解釋文獻報道RCC患者對抗VEGF治療的貝伐單抗治療優于LCC的原因[21]。

本研究進行Logistic多因素回歸分析顯示，腫瘤部位、大小、分化程度、脈管侵犯、KRAS基因突變率和VEGF陽性表達率均是結腸癌肝轉移的危險因素。

綜上所述，LCC、RCC二者在臨床、病理、基因及預后等多方面的生物學特性均存在較大差異性，解剖因素、KRAS基因和VEGF的差異性表達可能是影響其臨床病理和預后等不同的重要因素。本研究認為將二者視為不同病種研究治療更符合精準醫療原則。KRAS基因突變率和VEGF陽性表達率均是影響結腸癌肝轉移的危險因素。