基于斑馬魚毒理基因組學的化學品測試技術研究進展

王志浩，彭穎，王萍萍，夏普，張效偉,2,*

1. 污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023 2. 江蘇省環境保護化學品安全與健康風險研究重點實驗室，南京 210023

由于人類活動的需求，市場上使用的化學品已逾10萬種，大部分(80%以上)現有化學品的環境安全信息是缺失的，且每年新化學品進入市場的速度遠大于傳統化學品風險評價的速度[1-2]。依賴傳統的毒性測試(如利用大鼠、小鼠、兔子等模式動物進行測試)因為測試通量低、耗時長、成本高以及動物倫理問題[3]，已經不能滿足化學品毒性測試的需求[4]。發展快速、高效、低成本的化學品毒性預測技術已成為新的毒性測試思路[4-5]。另一方面，每年大約有3億噸化合物隨著工業、農業、生活用水和地表徑流匯入環境水體，導致水體的污染嚴重。同時，除水體的急性毒性外，大量化學污染物長期低濃度存在于環境水體中，因此，低濃度復合污染持續暴露對人類和生態環境健康產生的風險也逐漸引起人們的重視。如何識別和評價復合污染水體的生物效應和毒性是研究的難點[6]。

目前，復合污染水體的環境監測與風險評估主要依賴于化學分析手段。盡管隨著分析儀器的發展，利用高通量靶向分析與非靶向分析的技術手段可以檢測出復雜環境樣品中的上百種(甚至上千種)化學污染物，但是化學分析檢測出的化學物質并不能解釋復合污染的毒性，而且，環境中仍然存在現有分析手段無法檢測的未知化合物[7]。組學技術可以檢測生物體在基因組水平上生物學通路(biological pathway)的響應與改變，且致毒通路可以用來預測化學品潛在的毒性終點，為化學品優先性篩選及毒性預估提供指導[8]。基于生物效應為導向的分析(effect directed analysis, EDA)評估策略將體外生物測試方法應用于環境水體復合污染的生物效應監測和關鍵毒害物質的鑒定研究中，能夠有效檢測環境樣品的特定生物毒性效應[9]。然而，現今較為完善的以細胞為基礎的高通量體外篩選毒性測試只涉及較少的生物學通路，不能體現出生物個體水平的響應，限制了對潛在有害結局的預測和評估[10-11]。因此，需要開發一套新的毒性測試，能夠對環境水體的毒性及其有害結局進行評估和預測。

斑馬魚作為一種較為完善的模式脊椎動物，大量應用于基因研究、發育研究及生態毒理學研究等科研領域[12]，本文主要綜述了斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析及組學技術進展及其集成技術在化學品毒性篩選評估管理與水環境復合污染毒性監測中的應用，并對斑馬魚毒理基因組學測試技術在水環境管理中的應用前景進行展望。

1 斑馬魚胚胎測試(Zebrafish Embryo Testing Techniques)

相比傳統毒性測試，斑馬魚胚胎毒性測試具有以下優點：1)斑馬魚胚胎具有體外受精、體積小、透明易觀察、發育快以及實驗成本低等優點[13]；2)與標準成魚急性毒性測試之間有很好的相關性，可以替代成魚急性毒性試驗[14]；3)可以反映眾多的生物學通路和毒性終點，如內分泌干擾、心臟毒性及神經肌肉異常等[15]；4)斑馬魚基因組與人類基因組相似度高，其與發育相關的信號通路保守性強，為斑馬魚毒性測試的物種間毒性外推提供了基礎[16]；5)在1%二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)暴露條件下，斑馬魚胚胎的正常發育不會受到顯著影響，為疏水性化學品的毒性測試提供條件[17]。目前，斑馬魚胚胎測試已成為化學品毒性評價中常用的替代測試方法，可以快速高效準確獲取化學品毒性信息[18]，并為復合污染水體的生態風險評價提供更多毒性數據[15]。

斑馬魚胚胎測試方法已被普遍應用在化學品毒性評估方面，如經濟合作與發展組織(OECD)提出化學品急性及慢性毒性測試導則TG 212, TG 236。最近又有大量研究開發了更為高效的斑馬魚胚胎毒性測試體系，如自動化斑馬魚胚胎絨毛膜去除及自動化多孔板胚胎放置技術，提高了斑馬魚胚胎暴露效率[19]；基于384孔板的高內涵測試對(fli1:egfp)轉基因魚進行自動化捕捉獲取體長、心率、心血管速率等毒性指標數據，并且定量表征神經系統相關的自主尾部收縮活性，實現機器自動化觀測斑馬魚毒性終點，大大提高了測試效率[20]。但是，通過斑馬魚胚胎發育毒性測試(zebrafish embryo developmental toxicity test, ZEDT)得到的毒性終點指標主要為個體水平上的致死致畸等(如圖1表格)[20-24]，這些毒性終點的出現通常要求化學品暴露濃度很高，有時化學品濃度不能達到致毒濃度，且該方法并不能有效識別更敏感毒性效應終點，導致化學品毒性預測及環境風險評價過程中存在誤差。

斑馬魚行為分析(zebrafish photo motor response, ZPMR)是利用斑馬魚胚胎或幼魚的行為改變反映環境脅迫對斑馬魚胚胎發育影響的技術[25-26]。基于斑馬魚胚胎與幼魚行為分析技術能有效識別敏感的毒性測試終點，如運動活躍程度的改變等，有效表征化學品對神經功能的干擾[27-28]。研究顯示，低濃度暴露條件下斑馬魚的行為改變與高濃度暴露所引起的斑馬魚胚胎的畸形和死亡具有顯著相關性，該測試技術極大地提高了斑馬魚胚胎毒性測試的靈敏度[22,24,29]。有研究利用96 hpf斑馬魚行為分析毒性終點與斑馬魚成魚急性毒性建立毒性外推模型，準確利用行為分析的結果預測神經毒性化學品的成魚急性毒性LC50(半數致死濃度)，而這些化學品在以往斑馬魚胚胎發育毒性測試中一般毒性較弱，行為分析毒性指標的納入將大大提高斑馬魚胚胎測試體系的準確性[30]。由于斑馬魚行為分析測試的靈敏度較高，已有研究將該測試技術應用在復合污染環境水體的毒性評估中[31]。然而，行為分析仍是在個體水平上對化學品進行區分，無法對化學品的分子作用類型及毒性潛力大小進行系統評估。

圖1 斑馬魚發育毒性測試及行為分析流程圖Fig. 1 Zebrafish embryo developmental toxicity test

生物毒性(Biological Toxicity)斑馬魚胚胎發育毒性測試(Zebrafish EDT)斑馬魚行為分析(Zebrafish PMR)斑馬魚胚胎轉錄組測試(Zebrafish Transcriptome)致死 (Mortality)√○○發育毒性 (Developmental Toxicity)√○○神經毒性 (Neurotoxicity)×√○生殖毒性 (Reproductive Toxicity)××○遺傳毒性 (Genotoxicity)××○

注：√表示可以直接獲得該毒性終點；×表示不能獲得該毒性終點；○表示可以通過預測得到該毒性終點。

Note： √ Can get the endpoint by this method; × Can’t get the endpoint by this method; ○ Can predict the endpoint by this method; EDT stands for Embryo Developmental Toxicity Test; PMR stands for Photo Motor Response.

基于斑馬魚胚胎的毒性測試存在局限性，主要包括：1)斑馬魚并非中國本土物種，其對化學物質毒性的敏感性可能與本土生物有一定差異；2)斑馬魚胚胎正常培養孵化溫度為(28±2) ℃，因此不適用于低溫水體的原位分析；3)不同品系斑馬魚存在毒性敏感差異等。此外，斑馬魚胚胎測試在測試通量和毒性終點上但還存在以下不足：1)測試所用的毒性終點不全面，無法對化學品的生殖毒性及遺傳毒性進行評估(表1)；2)該測試方法只是在個體水平上對測試化學物質導致的胚胎的死亡、畸形等毒性終點進行評價，并不能揭示化學品毒性作用機制。

2 組學技術(Omics Techniques)

毒理基因組學(Toxicogenomics)是一種利用“組學”技術(如轉錄組、蛋白組、代謝組等)，研究化合物作用于機體引起的基因組水平變化，并利用基因變化評價和預測化合物毒性的新興學科[32]。與以表型為測試終點的傳統毒性測試不同，毒理基因組學檢測基因水平的毒性終點，具有更高的敏感性和特異性[32-34]。其中，轉錄組技術(如微陣列芯片、轉錄組測序技術等)能夠檢測全基因組的轉錄表達譜，反映最早期的生物分子響應，被廣泛應用于化合物生物標志物的鑒定及致毒機理的解釋[35-37]。而且，由于蛋白質及代謝物的豐度會影響蛋白質組及代謝組的檢出，其分辨率和應用范圍現今還不及轉錄組技術[38]。目前，毒理基因組學在環境污染物風險評價中的應用還十分有限，主要難題包括：1)根據基因水平變化預測表型毒性；2)對污染物的毒性進行定量評價；3)缺乏標準化的毒理基因學測試方法及分析流程；4)測試成本高昂，難以實現大量樣品的測試。

利用斑馬魚這一模式動物，可以將組學技術與傳統毒性測試相結合，為基因表達變化與表型毒性終點建立關聯提供有利的條件。斑馬魚轉錄組學已在化合物安全評價、作用機制研究、水生生態風險評估以及水體樣品毒性評估等領域得到應用[39-40]。有研究利用斑馬魚胚胎轉錄組研究阻燃劑mITP (monosubstituted isopropylated triaryl phosphate, mITP)的分子致毒機制，發現mITP是潛在的芳香烴受體(AHR)配體，并通過抑制視磺酸受體的生成誘發斑馬魚胚胎的心臟毒性[41]。

斑馬魚轉錄組學與斑馬魚胚胎毒性測試聯用后，可以將轉錄組學數據與表型毒性數據相關聯，結合分子網絡公共數據庫，能夠得到從分子響應到生物學過程，再到表型效應的網絡圖譜，從而為化學品致毒模式研究及環境風險評價提供新思路。有研究組利用斑馬魚胚胎研究了三氯乙烯(trichloroethylene, TCE)的毒性，主要對TCE暴露后，斑馬魚胚胎的血管生成、肌動蛋白、線粒體功能及轉錄組變化進行測試分析，結果表明轉錄組響應與生化指標的變化可以建立很好的關聯，TCE具有心臟毒性，并利用FAK信號通路(focal adhesion kinase signaling pathway)等生物學通路解析了TCE的毒性作用機制[42]。另外，有研究組綜合了斑馬魚胚胎毒性測試、轉錄組、q-PCR及轉基因魚系形態學觀察幾種測試方法，對污水處理廠出水的毒性進行了測試；同時，研究對水樣毒性的分子機制及生物標志物進行了分析，并結合有害結局路徑(adverse outcome pathway, AOP)框架對長期水樣暴露可能顯現出的斑馬魚形態毒性進行了預測，該研究為環境水體監測及風險評估方法的改進建立了基礎[43]。

有害結局路徑框架的提出將化學污染物的結構、致毒的分子啟動事件和有害結局建立關聯。因此，得到化學品或環境樣品的敏感分子響應后，可結合AOP對樣品最敏感毒性終點作出預測，這為化學品的毒性預測評估及環境復合污染監測提供了新的思路[44]。

組學研究可以根據劑量-效應關系對化學品毒性進行定量評價，預測毒性起始濃度(point of departure, POD)[45]。例如，研究表明，有些內分泌干擾物低濃度暴露后生物體內的基因變化是非單調的，這就表明其中存在新的分子機制[46]。另外，有研究表明利用斑馬魚胚胎進行多劑量實驗可以有效識別出雄激素響應基因[47]。而且，以差異表達基因活性值為基礎進行的生物學通路分析可以用于化學品的毒性診斷分析[48]。然而，面對大量的毒性測試，轉錄組測試成本高昂，缺乏標準數據分析方法，這些原因限制了轉錄組特別是基于多劑量基因組數據在危害識別中的應用[49-50]。因此，降低轉錄組成本及建立劑量效應模型的標準化生物信息學方法對組學技術在化學物質毒性測試中應用推廣至關重要。

3 簡化轉錄組測試(Reduced Transcriptome)

為了降低轉錄組測試成本，實現大批量化學品全劑量濃度的轉錄組測試，通過篩選關鍵基因對全基因組進行簡化，組成關鍵基因集代表全轉錄組信息。其基本原理是關鍵基因可以作為生物體分子網絡中共調控或共表達基因的替代物，來表征整個生物學通路網絡的動態響應[51]。本課題組利用該原理對人類簡化轉錄組(reduced human transcriptome, RHT)進行了試驗研究，挑選了1 200個關鍵人類基因作為RHT基因集，進行劑量效應模型分析。結果表明，該技術可以利用經暴露后細胞的動態生物學響應來表征環境樣品的潛在毒性效力，實現高效檢測水體質量的目標，大大節省了實驗成本[52]。

人類簡化轉錄組技術存在細胞類型單一、無組織結構等問題，為彌補該缺陷，有效增多毒害物質評估中的生物學通路，課題組在此基礎上用斑馬魚胚胎作為多細胞測試體系開展斑馬魚簡化轉錄組(reduced zebrafish transcriptome, RZT)研究，形成了一套標準化的基于斑馬魚模型的化學品簡化轉錄組測試與評價技術，其中包括毒性數據的獲取、分析及呈現過程。該研究通過挑選斑馬魚簡化基因集，結合Ion Ampliseq Technology測序形成斑馬魚簡化轉錄組測序技術(RZT-Ampliseq)，同時構建了RZT-Ampliseq與斑馬魚胚胎多劑量模型相結合的分析方法(RZT-Ampliseq-embyro)(如圖2)[53]。

3.1 實驗流程與方法

研究流程主要包括建立并驗證RZT測試平臺、建立生物信息學分析方法、將RZT應用于環境污染物的毒性評估三大部分：1)研究首先從斑馬魚生物學通路數據庫(包括KEGG和Gene Ontology數據庫)中，篩選得到1 000個斑馬魚的關鍵基因，并整合毒理學測試數據庫相關基因，建立一個由1 637個斑馬魚基因組成的RZT基因集，而后考察RZT基因集的生物學通路覆蓋度，并選取5個不同時期(24 hpf到成魚)的斑馬魚全轉錄組數據(來自NCBI數據庫)，考察簡化基因集對全轉錄組基因圖譜的定性和定量表征能力，同時確立斑馬魚胚胎暴露及樣品處理的實驗操作；2)對雙酚A(bisphenol A, BPA)(10～10E-5 μmol·L-1，10倍梯度稀釋)及4種環境水樣的有機污染物萃取液(10～6.4E-4富集系數，5倍梯度稀釋)進行斑馬魚簡化轉錄組測試，所得結果與已有的體外生物測試(invitrobioassays)及人類細胞的RHT測試結果進行比較；3)建立RZT生物信息學分析方法：利用劑量效應模型，計算各基因的效應濃度(effect concentration, EC)，挑選EC <= LOEC(最低有效應濃度)的基因作為差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)，將DEGs比對到生物學通路上，篩選出匹配到至少3個DEGs的通路，并根據其匹配基因EC值的平均值，作為該通路的效應濃度。

圖2 斑馬魚簡化轉錄組測試實驗分析流程圖[4]Fig. 2 Framework of reduced zebrafish transcriptome (RZT) experiment and data analysis[4]

3.2 結果分析

1)RZT平臺驗證：RZT基因集能覆蓋95%的生物學通路；能夠定性地模擬基于全轉錄組基因表達的聚類圖譜，定量地表征接近(差別<1個數量級)基于全轉錄組基因表達的毒性起始濃度；RZT-ampliseq測試可以為斑馬魚mRNA多元測序分析提供一種高通量、低成本的技術平臺。

2)劑量效應模型與生物學通路分析：利用劑量效應模型可以定量表征基因的效應濃度，進而用于生物學通路的定量表征，識別樣品的潛在敏感生物學通路。

3)基于生物學通路的毒性評估：對樣品的生物通路效應濃度進行排序，得到各個樣品的生物學通路敏感性分布曲線，計算各樣品的毒性潛力，識別潛在的高毒性樣品(如圖3)。

4)RZT、invitro測試以及RHT結果的比較：RZT的BPA測試結果與ToxCast 中的BPAinvitro測試相比，2種測試得到的生物學通路及其敏感性排序相似，但RZT測試的敏感性更高，得到的結果比invitro測試低3個數量級左右；使用RZT平臺得到環境樣品暴露后的敏感生物學通路結果與RHT結果一致(如圖3)。在環境樣品測試方面，RZT-ampliseq-embryo更全面、更敏感，且RZT可以檢測出invitro測試(103種)無法檢出的弱響應通路，如甲狀腺和下丘腦相關響應等，但RZT對雌激素受體類通路檢出敏感性較低，這一問題可通過調整胚胎樣品收集時間(> 48 hpf)解決；RZT分析得到的富集通路能夠與有害結局建立聯系，表征樣品可能導致的最主要的生物學終點。

綜上，斑馬魚簡化轉錄組技術的提出對毒理基因組學的發展有極大的促進作用，該技術從測試通量、成本、冗余去除等多方面彌補了全轉錄組的不足，使得高效、快速、經濟獲取大量化學品生物分子響應成為可能；結合斑馬魚胚胎全劑量模型，可以對暴露后響應基因及生物學通路做敏感性分析，從而得到生物體在該暴露條件下最敏感的毒性終點，有效避免了非單調響應基因信息缺失的問題；建立了一套較為完善的數據分析方案，為轉錄組數據處理提供了解決思路；與目前在篩選生物標志物研究中應用較廣的invitro測試相比，RZT平臺作為生物有機體測試系統可以覆蓋更多的生物學通路，它不但覆蓋了invitro測試的終點，還可以鑒別如發育、生殖相關的生物學通路。斑馬魚簡化轉錄組技術將會對化學品篩選管理、化學品毒性預測、化學品優先控制及環境監測治理等領域產生重大影響。

4 斑馬魚簡化轉錄組集成測試及其應用前景(Application Prospect of Reduced Zebrafish Transcriptome Aggregate Testing Method)

4.1 化學品測試、篩選、毒性預測與評估

斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析及斑馬魚簡化轉錄組同時應用構建為斑馬魚簡化轉錄組集成測試技術。在化學品測試中，可利用斑馬魚簡化轉錄組得到化學品暴露后生物體最敏感的生物學響應，將其與斑馬魚胚胎毒性測試、行為分析的表型效應等結果相結合，能夠對化學品致毒機制進行解析，并建立化學品生物毒性數據庫，進而實現對大量化學品的優先性篩選；另一方面，可以將毒理基因組學與傳統毒理學檢測方法結合，利用組學對化學品的整體毒性進行評估，確定其主要毒性后，再進行單獨毒性的定量分析，這樣能夠為定量毒性檢測提供毒性機理上的支持，從而增強風險評價的可靠性。此外，利用該技術得到的早期分子響應也可以為化學品毒性效應預測提供數據基礎；由于斑馬魚轉錄組可以實現跨物種模型比對，因此可以利用該技術的轉錄組毒性信息進行毒性物種間外推。由于化學品毒性測試數據的缺乏，若將該高通量測試方法標準化，形成具有自主知識產權的化學品毒性測試技術體系和相關技術標準，形成的化學品毒性數據庫可以為我國化學品安全管理提供技術支撐。

利用斑馬魚簡化轉錄組集成測試技術可以高通量、低成本的獲得化學物質對生物體多維毒性信息，并將體內試驗終點與生物個體有害結局直接相關，基于現有生物學信號網絡整合不同層級毒性信息完善AOP框架，為實現化學品的毒性預測提供條件(圖4)。

4.2 復合污染毒性測試、評估與診斷

在環境監測方面，將斑馬魚簡化轉錄組集成測試技術與AOP框架相結合，對復合污染進行毒性預測和評估。利用該方法可以得到環境樣品暴露后分子水平響應的敏感性差異，并基于分子效應可以對不同環境樣品的毒性潛力進行評估；而且，將初始分子響應與AOP結合可以找到環境樣品最敏感的毒性效應終點，從而為后續建立不同水體環境監測與管理特異性指標體系提供方向。

與EDA常用的生物體外毒性測試手段相比，利用斑馬魚簡化轉錄組集成測試能夠反映生物的整體效應，不再局限于某種特定的效應終點，將其與EDA相結合，應用于環境水體復合污染的生物效應監測和關鍵毒害物質的鑒定研究中，為化學品優先管控提供指導。

此外，由于斑馬魚簡化轉錄組集成測試平臺靈敏度高，也適用于環境中低濃度暴露的風險評估，這就為水源水、飲用水等相對干凈水體的風險評估提供了技術支撐，如對自來水廠出水或不同處理工藝段的水質評估提供測試手段。

5 結語(Conclusions)

由于目前化學品的多樣性以及環境水體復合污染的復雜性，建立高效的生物測試是今后化學品與環境污染物毒性評估研究的必然趨勢。隨著技術的不斷發展，越來越多的基于斑馬魚模型的毒性測試方法被開發應用，其在環境監測管理中的應用也逐漸普及。采用多種斑馬魚測試技術聯用是今后斑馬魚毒理學模型的一個發展方向。斑馬魚簡化轉錄組集成測試作為一種高效準確的集成測試方法，有廣闊的應用前景。斑馬魚簡化轉錄組集成測試，包括毒理基因組學、胚胎毒性測試、行為分析測試，與傳統動物測試相比，不僅大大提高測試通量與效率，降低測試成本，并且從生物多層次(分子、細胞、組織、器官、個體)水平表征化學品毒性，揭示化學品毒性致毒機制信息，幫助構建分子水平到毒性效應終點聯系，為基于“毒性通路”的預測毒理學應用于化學品毒害風險識別提供新機遇。另外，該測試技術可在環境風險評價中起到重要作用：一方面，可利用該集成測試技術建立毒性信息更為全面的化學品毒性數據庫，將分子指標、個體指標及化學品結構信息相關聯，為關鍵致毒化學品溯源及優控管理提供數據基礎；另一方面，該集成測試技術可應用于復合污染的研究中，為樣品中關鍵致毒物質篩查提供新的解決思路。