環境DNA(eDNA)宏條形碼技術對枝角類浮游動物物種鑒定及其生物量監測研究

孫晶瑩，楊江華，張效偉

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環境學院，南京 210023

隨著高通量測序技術的發展，基于環境DNA(eDNA)序列解析混合樣本或環境介質物種組成的eDNA宏條形碼(eDNA Metabarcoding)技術[1]被逐漸應用于生物學的各個領域，如微生物多樣性分析、罕見種和入侵物種監測、浮游植物[2]、水生動植物生物多樣性分析、食物網結構重建等[3-5]研究。目前，eDNA宏條形碼研究多集中在物種識別和物種多樣性分析，關于其對物種定量關系的研究相對較少，這也為該技術在實際環境監測中的應用帶來困難。

浮游動物是水生生態系統重要的組成部分，作為生物標志物能很好地指示水環境質量[6-7]，如龜甲輪蟲(Keratellasp.)、臂尾輪蟲(Brachionussp.)、秀體溞(Diaphanosomasp.)、擬裸腹溞(Moinodaphniasp.)等可以作為水體富營養化的指示生物[7]。2017年，有研究首次建立了太湖流域浮游動物條形碼數據庫[8]，并開發了基于eDNA的物種識別和高通量生物監測技術用于太湖流域浮游動物多樣性研究，而且發現eDNA宏條形碼技術能夠顯著提高浮游動物物種識別能力和簡化浮游動物多樣性分析[4,9-14]。盡管這上述研究發現浮游動物生物量與序列數之間存在一定線性關系，并提出可用物種序列數評估物種豐度，但在eDNA宏條形碼技術對物種定量的準確性方面并未做深入探討，浮游動物eDNA宏條形碼技術的定量體系仍然不夠完善。

傳統水生生物學研究中，大多通過人工鑒別物種多樣性和生物量來反映物種豐度。盡管傳統定量方法簡單，但其未考慮物種個體差異，并且需要專業的物種鑒定人員、耗時耗力[9-10]。eDNA宏條形碼是對eDNA的特定區域進行擴增，通過高通量測序進行序列識別[15]，其基本檢測單位為eDNA[16]，這與傳統以生物個體數為直接觀測單位進行定量分析差異巨大，如何采用eDNA定量監測不同物種的豐度問題尚未得到徹底解決。雖然eDNA宏條形碼和熒光定量PCR(Quantitative PCR, qPCR)[17-18]均通過檢測物種DNA濃度反映物種多度，充分考慮了物種個體差異(尤其是幼體和成體的區別)，理論上提供了更加準確的物種定量結果，但是eDNA宏條形碼多采用通用引物擴增環境中的多個物種，并在PCR循環結束后進行集中測序，沒有對PCR過程進行連續檢測，其定量結果的可靠性還有待研究(表1)。eDNA宏條形碼技術定量研究的缺乏，也極大的限制了該技術在實際環境監測中的應用。

本研究以太湖流域常見浮游動物擬同形溞(Daphniasimiloides)、大型溞(Daphniamagna)、蚤狀溞(Daphniapulex)、多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)、老年低額溞(Simocephalusvetulus)為研究對象，通過浮游動物不同個體數混合和研究qPCR和eDNA宏條形碼技術對浮游動物定量準確性，提出基于eDNA 宏條形碼技術的浮游動物物種定量體系。主要分以下四方面進行研究：(1) eDNA宏條形碼通用引物和qPCR物種特異性引物設計和選擇；(2) qPCR物種定量標準方法構建；(3) 用eDNA宏條形碼方法定量物種相對豐度驗證；(4) eDNA宏條形碼物種相對豐度定量與qPCR物種定量結果的比較。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗對象

實驗采用的5種浮游動物，大型溞(D.magna)、擬同形溞(D.similoides)、蚤狀溞(D.pulex)、多刺裸腹溞(M.macrocopa)、老年低額溞(S.vetulus)分離自太湖流域，并在實驗室馴化培養超過1年，培養于pH為7.8～8.3的曝氣水中，每周換水3次，投喂密度為6×106～8×106cells·mL-1的斜生柵藻。食物培養方法：在滅菌的BG11培養液中接入斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)，曝氣培養3～4 d，離心濃縮。

表2 qPCR引物設計Table 2 The primer for qPCR

注：物種特異性引物名稱對應物種，即大型溞，COI.DM；蚤狀溞，COI.DP；擬同形溞，COI.DS；多刺裸腹溞，COI.M；老年低額溞，COI.SV。Tm表示引物退火溫度。

Note： species-specific primers correspond to species names.Daphniamagna, COI.DM;Daphniapulex, COI.DP;Daphniasimiloides, COI.DS;Moinamacrocopa, COI.M;Simocephalusvetulus, COI.SV. Tm stands for melting temperature.

圖1 eDNA宏條形碼技術對浮游動物物種定量檢測Fig. 1 Quantitative monitoring of zooplankton species with eDNA metabarcoding technology

1.2 研究方法

利用通用Folmer引物[19]擴增出大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞、擬同形溞COI片段，并將PCR產物克隆到pEASY?-T3(TransGen Biotech)中，構建qPCR標準質粒。同時利用COI片段設計qPCR特異性引物和eDNA宏條形碼通用引物(表2)。5種枝角類分別按照固定個體數量混合，然后分別用qPCR和eDNA宏條形碼技術進行物種定量分析(圖1)。

1.2.1 單物種DNA提取

使用E.A.N.A.?Tissue DNA Kit(OMEGA)試劑盒提取單物種DNA，具體操作如下：用無菌無酶吸管挑取10只生物個體，將水吸干，加入200 μL TL Buffer、25 μL OB Protease Solution渦旋混勻，55 ℃水浴裂解約3 h，每20～30 min拿出渦旋；13 000×g離心5 min取上清；加220 μL BL Buffer渦旋混勻，70 ℃孵育10 min；加220 μL無水乙醇后過HiBind?DNA Mini柱富集DNA；分別加500 μL HBC Buffer和700 μL DNA Wash Buffer清洗DNA，重復2次后用100 μL Elution Buffer洗脫；用Qubit 2.0測定DNA濃度。

1.2.2 混合物種DNA提取

5種枝角類按照表3進行混合，共7個處理組，大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞在每個處理組間生物個體數不變，均為5只，擬同形溞在7個處理組間不斷增加1～320只，每個處理組設置3個重復。

混合浮游動物使用MO BIO PowerWater?DNA Isolation Kit (QIGEN)進行DNA提取。具體操作如下：將濾膜放入5 mL PowerWater?Bead離心管中加1 mL 55 ℃預熱的裂解液，用MO BIO Votex Adapter 13000-V1-15混勻裂解10 min，離心取上清。后續提取步驟與單物種提DNA方法相似：去雜質，清洗DNA，洗脫。用Qubit 2.0(Thermo Fisher Scientific, USA)進行DNA濃度測定。

1.2.3 引物設計

用Folmer引物[19-20](表2)分別對5個不同枝角類物種的DNA進行線粒體COI區域擴增，PCR擴增體系：總體積50 μL，包含Transtaq SuperMix (TransGen Biotech) 25 μL，ddH2O 21 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL；擴增條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。用1.5%的瓊脂糖凝膠進行條帶檢測，用MicroElute DNA Clean Up Kit (OMEGA)純化，純化產物進行Sanger測序(南京金斯瑞)，獲得5個物種的標準COI片段。用Primer premier 6設計物種qPCR特異性引物(表2)，每對引物均獲得單一清晰的特異性條帶。使用VECTOR NTI軟件進行序列比對，根據兼并引物設計原則進行通用引物設計(表2)。

1.2.4 浮游動物實時熒光qPCR定量

將Folmer引物擴增的5個物種標準COI片段的特異性序列導入pEASY?-T3載體，構建5個物種標準質粒。操作步驟：將準備好的PCR產物和T3克隆載體輕輕混勻后置于冰上進行載體連接約5～10 min；然后將插入標準COI片段的T3載體導入Trans-T1感受態細胞，輕彈混勻冰浴進行轉化；均勻涂布在LB培養基板上，過夜培養。挑選陽性克隆到50 mL無菌LB培養基中搖菌6 h，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit (TransGen Biotech)提取質粒DNA，分別用物種特異性引物和M13引物(表2)擴增檢測。用Qubit 2.0進行質粒DNA定量，每個物種的標準質粒按10倍間隔向下稀釋5個數量級。

qPCR(三步法)實驗反應體系20 μL：TranStart Top Green qPCR Supermix (TransGen Biotech) 10 μL，ddH2O 7.8 μL，COI特異性引物0.4 μL，DNA模板1 μL，Passive Reference Dye 0.4 μL；反應條件：94 ℃預變性30 s，40個循環(94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s)，信號采集設置在退火步驟，采集時間31 s。

根據DNA濃度及計算公式計算標準質粒DNA拷貝數(見1.4)。將稀釋的5個質粒DNA樣品所得CT值與標準質粒轉化后拷貝數(log10轉化)構建標準曲線，計算每個樣品拷貝數，每個樣品3個重復。

1.2.5 eDNA宏條形碼分析

在通用引物前加上8個堿基短序列來區分不同處理組(表4)。PCR反應體系共50 μL，包括Phusion酶0.5 μL，ddH2O 31.5 μL，HF Buffer 10 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，DNA模板2 μL。擴增條件：98 ℃預變性30 s，35個循環反應，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，E.Z.N.A.TME-Z 96×5 Cycle-Pure Kit (OMEGA)試劑盒純化樣品，Qubit 2.0進行DNA濃度檢測，各樣品按50 ng等量混合構建DNA文庫。取混合DNA 100 μL再一次純化(Agencourt AMPure XP kit, Becman Coulter)，用Ion Plus Fragment Library Kit (Life Technoloiges)試劑盒構建DNA文庫，Agilent 2100檢測DNA文庫質量，稀釋DNA文庫至100 pmol·L-1用Ion torrent OT2 200 Kit(Life Technoloiges)試劑盒將測序文庫連接到Ion Sphere Particles(ISPs)表面，用Ion torrent PGM(Life Technoloiges, USA)測序儀進行測序。

表3 混合樣品中物種個體數和擬同形溞占比Table 3 The number of species in multi-species samples and the proportion of Daphnia similoides

1.3 數據處理

標準質粒拷貝數計算公式：

Copies = [(6.02×1023)×C/(L×660)]×V

(1)

Copies為拷貝數；C為標準質粒DNA濃度，單位ng·μL-1；L為標準質粒DNA長度，單位bp；V為實時熒光qPCR體系中標準質粒DNA體積。

測序數據處理方法：利用Fastx toolkits將FASTQ文件轉換成FASTA格式文件和相應的質控文件；在QIIME(Quantitative Insights into Microbial Ecology)綜合計算平臺下去除Q < 20的低質量序列，包括引物錯配和長度小于110 bp大于120 bp的序列，在COI313引物組去除長度小于250 bp的序列和引物錯配序列。使用UCHIME程序識別并去除嵌合子；利用基于UPARSE算法的USEARCH計算OTUs(Operational Taxonomic Units)，并用SAP(Statistical Assignment Package)進行基于NCBI核酸數據庫的OTUs序列注釋。以上測序數據處理均在Linux系統下操作完成。形成注釋的OTUs文件后用R語言進行后續數據處理。

數據標準化方法：qPCR和eDNA宏條形碼2種定量方法的計量單位不同，結果比較需標準化。用“Hellinger”轉化方法將qPCR物種拷貝數與eDNA宏條形碼物種序列數標準化。SPSS 22.0進行線性回歸分析，相關回歸圖形在Tableau和GraphPad Prism 5軟件中繪制。

2 結果(Results)

2.1 qPCR物種特異性引物與eDNA宏條形碼引物

圖2 4對通用引物瓊脂糖凝膠電泳測試圖，5個物種簡稱見表2附注，Ladder為100 bp。Fig. 2 The chart of 4 pairs of universal primer agarose gel electrophoresis test. The short names of 5 species referred to table 3 note, ladder is 100 bp.

序號No.Barcode序列Barcode sequence序號No.Barcode序列Barcode sequence1AGATGCAG12AGCTGCTG2AGATGCTC13ATCAGATC3AGCAGAGC14ATCAGCTG4AGCAGATG15ATCATCAG5AGCAGCAG16ATCATCTC6AGCAGCTC17ATCTCATC7AGCATCTG18ATCTCTGC8AGCATGAG19ATCTGAGC9AGCTCAGC20ATCTGATG10AGCTCATG21ATCTGCAG11AGCTGATC

圖3 eDNA宏條形碼通用引物COI116和COI313在物種識別上結果對比注：左COI.116(COI116)引物可以將5個物種同時檢測出，而右COI.313(COI313)引物不能檢測出蚤狀溞。Fig. 3 The differences in species identification of universal primer COI116 and COI313 for eDNA metabarcoding technologyNote: the left primer COI.116 (COI116) identify 5 species at the same time; the right one can not identify D. pulex.

圖4 物種拷貝數與個體數占比間的關系注：A圖表示擬同形溞在DR1～DR7組中個體數占比與其拷貝數相關性，包括擬合曲線和95%置信區間；B圖表示其他4個物種在DR1～DR7組間拷貝數的變化。Fig. 4 The relationship between species copies and the proportion of species individualsNote: (A) the correlation of Daphnia similoides copies and proportion of individuals among DR1-DR7 treatment, including fitting curve and 95% confidence interval; (B) The change of the other 4 species copies among DR1-DR7 treatment.

短COI116較符合eDNA宏條形碼通用引物篩選標準。5個物種特異性引物PCR產物長度分別為大型溞166 bp，蚤狀溞117 bp，擬同形溞152 bp，多刺裸腹溞111 bp，老年低額溞250 bp。共設計出4對通用引物，分別對5個物種DNA進行PCR測試，引物3即COI116(表2)可以同時擴增出5個物種，且PCR產物長度、凝膠電泳條帶清晰單一，為最符合條件的引物對(圖2)。因此選用COI116引物進行eDNA宏條形碼定量后續引物測試。

通用引物COI116和COI313[4,8,11]在5個物種檢測結果中存在明顯差異(圖3)。隨機將5個物種DNA與南大校內池塘eDNA混合在一起作為引物測試標準樣品，結果表明，COI116引物擴增目的條帶長116 bp，能同時檢測出5個物種，且擴增產物中不包含這5個物種外的其他物種序列；COI313引物擴增目的條帶長313 bp，能同時檢測出4個物種，無法檢測出蚤狀溞，而且對裸腹溞的檢測率差，但能夠檢測出樣品中包含的其他物種。COI116更加適合進行eDNA宏條形碼定量研究。

2.2 qPCR方法對多物種混合樣品中單物種的定量分析

構建的5個物種標準質粒長度和濃度分別為：大型溞質粒長度3 205 bp，質粒DNA濃度13.9 ng·μL-1；擬同形溞質粒長度3 191 bp，質粒DNA濃度22 ng·μL-1；蚤狀溞質粒長度3 156 bp，質粒DNA濃度17.5 ng·μL-1；多刺裸腹溞質粒長度3 150 bp，質粒DNA濃度13.5 ng·μL-1；老年低額溞質粒長度3 289 bp，質粒DNA濃度16.6 ng·μL-1。

qPCR物種拷貝數與個體數相對比例變化呈顯著正相關。相對比例變化的擬同形溞在不同處理組間標準化拷貝數變化與其個體數占比線性回歸(圖4A)，擬同形溞標準化拷貝數隨著其在DR1-DR7處理組個體數占比增加而明顯增加。占比由0.27增加至0.98，增加了0.71，拷貝數與物種占比間存在顯著相關性(R2=0.929,P<0.0001)；而大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞和老年低額溞雖然在7個處理組間個體數目未發生變化，但相對占比不斷減小，4個物種標準化拷貝數值總和隨著個體占比的減小而顯著減少，由1.69降至0.30，降低了1.39(圖4B)。5個物種拷貝數均與個體數相對比例變化呈相同趨勢變化。

2.3 eDNA宏條形碼對混合物種的定量分析結果

eDNA宏條形碼定量分析的序列數與物種個體數相對占比呈一致性變化趨勢。COI116引物高通量測序結果按錯配堿基數小于3個，最低相似度為95.69%，共篩選出DNA序列27 069條(110～120 bp)，聚類23個OTUs，其中大型溞OTUs 6個，蚤狀溞1個，擬同形溞4個，老年低額溞3個，多刺裸腹溞9個。在DR1-DR7處理組間，eDNA宏條形碼所獲得的擬同形溞標準化序列數由0.17增加至0.69，增加了0.52，標準化序列數與相對比例呈顯著正相關(R2=0.885,P<0.0001)(圖5A)；大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞4個物種標準化后序列數由1.74降為1.30，下降了0.44，標準化后序列數隨DR1-DR7組間物種相對比例減少而減少(圖5B)。高通量分析序列數與物種相對比例間的關系和qPCR物種拷貝數與物種相對占比的關系呈現一致性變化趨勢。

圖5 物種序列數與個體數占比間的關系注：A圖表示擬同形溞在DR1～DR7組中個體數占比與其序列數相關性，包括擬合曲線和95%置信區間；B圖表示其他4個物種在DR1～DR7組間序列數的變化。Fig. 5 The relationship between species sequences and the proportion of species individualsNote: (A) the correlation of Daphnia similoides sequences and proportion of individuals among treatment DR1-DR7, including fitting curve and 95% confidence interval; (B) The change of the other 4 species sequences among treatment DR1-DR7.

圖6 DR1～DR7處理組間擬同形溞拷貝數與序列數相關性Fig. 6 The correlation between Daphnia similoides copies and sequences among treatment DR1-DR7

2.4 qPCR & eDNA宏條形碼單物種定量比較分析

擬同形溞拷貝數與物種序列數變化呈顯著正相關，且均隨物種相對占比增加而增加。其個體數占比由4.76%增加至94.12%，標準化后物種拷貝數值隨個體占比約增加了0.71；標準化序列數值隨其個體數所占比例約增加了0.52。將標準化拷貝數值與標準化后的序列數進行線性回歸(圖6)，擬同形溞從DR1組到DR7組，序列數與擬同形溞拷貝數變化趨勢一致，呈顯著正相關(R2= 0.767，P<0.0001)。大型溞、蚤狀溞、多刺裸腹溞、老年低額溞4個物種標準化拷貝數值由DR1到DR7處理組降低了1.39，4個物種標準化序列數值由DR1到DR7處理組降低了0.44，拷貝數與序列數下降幅度不同，但是均呈現均勻下降趨勢。物種序列數變化與物種拷貝數趨勢一致，能夠反映物種拷貝數變化。

3 討論(Discussion)

3.1 引物偏好性對eDNA宏條形碼物種監測、定量的影響

eDNA宏條形碼技術的定量檢測受PCR引物的偏好性影響。目前應用于浮游動物監測的通用引物有基于線粒體的16S rDNA[21]、COI、12S rDNA標志基因[22-23]，基于細胞核的18S rDNA[24]、rRNA[25]和28S rDNA[26]的標志基因。通用引物在設計時為了能同時擴增出盡可能多的物種，簡并度較高，也導致引物對物種的擴增能力存在較大差異。COI313引物是目前浮游動物宏條形碼研究最常用的引物之一[4]，具有較好的物種覆蓋度和辨識度。利用通用引物進行混合物種DNA擴增，通常會導致較大的物種擴增效率差異[27]，有研究建議在物種監測中不同生物類群使用不同引物[28]。其他研究也發現樣品重復間的引物偏差較小，而不同COI引物組間物種序列數差異較大[3]。在本研究中，COI313引物能夠在單物種測試中成功擴增出5種枝角類的COI序列，但是，當將5種枝角類的DNA混合在一起時，COI313引物僅能擴增出4種浮游動物，無法擴增出蚤狀溞，而我們根據5個物種的COI序列設計的COI116引物能夠同時擴增出5個物種。這說明COI313引物存在明顯物種偏好性，盡管其被廣泛應用于生物多樣性評價研究中，但是無法對多物種進行定量檢測。為驗證宏條形碼定量檢測能力而設計的COI116引物雖然可以同時擴增出5種枝角類，能夠用于枝角類多樣性監測和定量分析，但是其在其他群落中普適性有待進一步研究。綜上，eDNA宏條形碼引物在監測、定量過程中存在較大偏好性，需根據研究目的篩選合適的引物。

3.2 qPCR與eDNA宏條形碼對浮游動物多物種定量的比較

eDNA宏條形碼定量結果與qPCR定量結果一致，eDNA宏條形碼技術可實現浮游動物群落半定量監測。qPCR技術廣泛應用于基因定量，也能根據標記基因對物種定量[17,29]，其優勢在于可以進行DNA拷貝數的絕對定量[30-31]，已成為DNA定量的金標準。常用的eDNA宏條形碼物種定量研究是基于有機體的生物量與DNA的正比關系，研究發現物種序列與物種生物量、DNA濃度呈正比關系[3,32-33]，而以生物豐度為單位的eDNA宏條形碼研究很少且定量體系不夠成熟。

eDNA宏條形碼定量監測能用于研究浮游動物物種相對豐度的變化。本研究通過對混合樣品中各物種豐度同時進行qPCR定量和eDNA宏條形碼定量，比較qPCR拷貝數和eDNA宏條形碼序列數的關系，驗證eDNA宏條形碼定量的準確性，從而構建基于eDNA宏條形碼技術的浮游動物物種定量體系。結果發現5個浮游動物物種拷貝數與個體數占比呈現一致性趨勢變化(R2=0.929,P<0.0001)，這表明qPCR拷貝數能夠反映物種相對豐度變化趨勢，可作為衡量eDNA宏條形碼定量準確性的標準。eDNA宏條形碼序列數與混合物種個體占比呈明顯正相關(R2=0.885,P<0.0001)，表明eDNA宏條形碼序列數變化能夠反映浮游動物類群中物種的豐度變化。將eDNA宏條形碼定量獲得的序列數與同處理組qPCR定量拷貝數進行比較，發現物種序列數與拷貝數隨物種個體數所占比例變化呈現顯著的一致性變化(R2= 0.767,P<0.0001)。物種拷貝數與序列數下降幅度有顯著差異，主要原因可能是2種方法的定量單位不同而導致的通量不同，對研究結果無明顯影響。綜上所述，eDNA宏條形碼可用來研究浮游動物物種相對豐度的變化。

3.3 eDNA宏條形碼技術的半定量監測

eDNA宏條形碼技術能夠實現浮游動物物種半定量監測。qPCR通過連續檢測PCR過程中PCR產物的含量，進而準確計算模板DNA濃度。而eDNA宏條形碼技術僅僅在PCR結束后進行測序，最終獲得的是DNA產物的序列數，并沒有連續檢測PCR擴增過程，因此僅能對模板DNA進行半定量檢測，進而實現對物種生物量的半定量監測。

綜上，在選擇適合的引物基礎上，eDNA宏條形碼技術能夠實現浮游動物的半定量檢測。本研究通過對5種浮游動物混合樣品中各物種豐度進行qPCR和eDNA宏條形碼的定量分析，評估了eDNA宏條形碼定量的準確性，結果表明，eDNA宏條形碼引物通常存在較大的偏好性，選擇適合的引物可識別生態群落中不同的物種。同時，eDNA宏條形碼與qPCR定量檢測均與物種個體數相對比例變化存在較強的一致性，能夠反映物種豐度變化。該研究為eDNA宏條形碼技術在浮游動物多樣性監測和生物完整性評價中的應用提供依據。