基于FH插值法構建的二元有機磷農藥聯合作用新模型在等效線圖法中的研究

朱濤，趙前進，王春花

1. 安徽理工大學醫學院，淮南 232001 2. 安徽理工大學數學與大數據學院，淮南 232001 3. 莆田學院環境與生物工程學院，莆田 351100

有機磷農藥在我國的農業生產中占農藥使用量的60%～70%，常使用二元混配來提高藥效[1]，混合農藥可通過不同的組合方式構成，各組分濃度或濃度配比發生變化時，農藥混合物可能會發生更為微妙和復雜的相互作用[2]，產生不同的毒性效應，如有機磷農藥混合后多數表現為相加或協同作用[3-4]，但也在其他濃度組合下存在拮抗作用，如敵敵畏與乙酰甲胺磷、毒死蜱、辛硫磷、樂果等[5-8]。因此，對于混合物毒性效應的評價與預測的模型，在生態毒理學中，目前常用的加和參考模型有濃度加和模型(concentration addition, CA)和獨立作用模型(independent addition, IA)，通常認為CA模型適用于評估具有相似作用模式化學物的混合物，而IA模型則適用于具有相異作用模式化學物的混合物[9]。由于大多數混合物的作用機理尚不明確，作用模式的相似度問題并未有嚴格、統一的判斷標準，使得選用CA或IA難以確定，CA雖然常被認為是混合物預測的標準模型，卻缺乏堅實的理論支持[10]。在加和模型中，等效圖法是一種評價二元混合物相互作用的經典分析方法，它是具有相同效應(通常是半數效應)的濃度點組合，構成的二維濃度圖，可描述混合物中兩組分之間的毒性相互作用，但若要獲得較為完成的等效線圖，須按固定濃度比來設計具有多種濃度比的大量二元混合物毒性測試[11]。近年來，該方法被一些學者重視并有相應的研究成果，如利用等效線圖法，吳宗凡等[12]對重金屬與有機磷農藥二元混合物對鹵蟲聯合毒性的評價及預測；王成林等[13]對離子液體與甲霜靈二元混合物的聯合毒性的研究；Zhang等[14]對4種二元混合物的9種混合效應的研究等；另外，Salat等[15]用一種新等效線圖法研究鎮痛藥相互作用；Luszczki等[16-17]拓展了三維等效線圖法的研究等。因此，本文在前期基于FH插值法理論[18]構建二元有機磷混合物聯合作用新模型的基礎上，為進一步探索新模型在評價二元混合農藥中的應用，選擇野生型秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)為受試生物，利用敵敵畏(dichlorvos, DDVP)和久效磷(monocrotophos, MCP)2種有機磷農藥混合物進行聯合毒性試驗，將三維聯合作用曲面與二維等效線圖結合，構建三維等效線圖，以期將二元混合農藥之間的相互作用實現可視化表征，并快速、全面、有效地判斷聯合毒性作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

野生型秀麗隱桿線蟲N2株由國際線蟲遺傳中心提供，安徽理工大學地球與環境學院環境與健康實驗室進行同步化培養[19]。敵敵畏(分子式C4H7Cl2O4P，CAS號62-73-7，純度98%)與久效磷(分子式C7H14NO5P，CAS號6923-22-4，純度99%)均為美國Sigma公司產品。

1.2 毒性試驗

急性毒性試驗：分別將DDVP、MCP溶解于含E.coliOP50的Km溶液(53 mmol·L-1NaCl，32 mmol·L-1KCl)；DDVP暴露濃度選擇15 μmol·L-1、30 μmol·L-1、45 μmol·L-1、60 μmol·L-1、75 μmol·L-1、100 μmol·L-1；樂果暴露濃度為5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、15 mmol·L-1、20 mmol·L-1、25 mmol·L-1、30 mmol·L-1、35 mmol·L-1。20 ℃下置于24孔板中培養線蟲，10條/孔同步化的L4期(56 h±0.5 h)線蟲，設4個平行孔/組，將線蟲放入不同濃度染毒液作用4 h后，顯微鏡下觀察，用鉑金絲針輕觸線蟲后無任何反應，則視為個體死亡，記錄死亡線蟲數目，實驗重復3次，線蟲死亡率取平均值。 聯合毒性試驗：DDVP濃度設置為10 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1；MCP濃度設置為5 mmol·L-1、10 mmol·L-1、20 mmol·L-1，以3×3矩形數據要求配制混合染毒濃度進行聯合毒性試驗。實驗方法同急性毒性試驗，實驗重復3次，線蟲死亡率取平均值，同時設置空白對照組[20]。

1.3 數據處理

利用FH插值分析法計算二元有機磷農藥混合物聯合作用表達式，方法參見文獻[8]；利用SPSS16.0分析軟件中概率單元法，計算單一農藥急性染毒作用24 h下，分別致秀麗隱桿線蟲30%、50%、70%致死率對應的農藥濃度(以下分別簡稱LC30、LC50、LC70)及95%置信區間(CI)[21-22]；使用R軟件對聯合毒性結果進行交互性分析；基于Matlab13.0繪制聯合效應曲面和不同致死效應的等效線等圖形。

1.4 等效線圖法

等效線圖法(Isobologram)于1953年由Loewe提出[23]，1981年Berebaum給出了多種生物活性物質混合物的等效線圖[24]，分析了混合物毒性相互作用，進而進行判別混合物是否產生協同、加和或拮抗作用。分析步驟如下：(1)分別求出2種化合物單一作用下的LC50及CI，再分別以橫、縱坐標代表2種化合物的劑量并取各自LC50點相連為直線，若該混合物中2種化合物無相互作用，這條直線即為50%效應的濃度加和等效線(簡稱加和等效線)，2種化合物的CI值的上、下限分別連接，圍成50%效應的加和等效線置信區間；(2)依據預測混合物致線蟲50%死亡效應的濃度中2種化合物各自實際的劑量，對應的坐標點即混合物50%效應的觀測等效點；(3)根據觀測等效實驗點與加和等效線置信區間的位置關系，對聯合作用進行評價。觀測點落在加和等效線置信區間，則為相加作用；落在下方，則為協同作用；落在上方，則為拮抗作用[25]。同理，加和等效線還可以取30%效應、70%效應等任意效應進行判斷。

圖1 DDVP、MCP單一作用秀麗隱桿線蟲的劑量-效應曲線Fig. 1 The dose-effect curves of dichlorvos (DDVP) and monocrotophos (MCP) solely on C. elegans

LC30LC50LC70DDVP concentration/(μmol·L-1)35.40(CI: 26.85～41.64)43.55(CI: 36.00～50.76)53.58(CI: 45.99～64.95)MCP concentration/(mmol·L-1)13.15(CI: 9.12～16.07)16.96(CI: 13.35～20.55)21.87(CI: 18.11～28.36)

圖2 DDVP與MCP聯合作用的效應曲面與等效線圖Fig. 2 The isobologram and the surface of combined effects of DDVP and MCP

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 單個物質對秀麗隱桿線蟲的急性毒性

利用SPSS16.0 計算DDVP及MCP單一作用下，對秀麗隱桿線蟲LC30、LC50、LC70及CI，結果見表1，可見同一致死率下，DDVP濃度遠低于MCP濃度，故DDVP毒性大于MCP。另外，通過Origin8.0繪制DDVP及MCP單一作用時的劑量-效應曲線圖，如圖2所示，可見單一作用下，線蟲死亡率與MCP、DDVP呈劑量依賴關系。

2.2 農藥混合物對秀麗隱桿線蟲的聯合毒性

不同濃度配比下DDVP與MCP混合物聯合作用秀麗隱桿線蟲4 h的死亡率，如表2所示。當DDVP濃度固定時，線蟲死亡率隨MCP濃度的增加而增加，但DDVP濃度為50 μmol·L-1時，線蟲死亡率達到100%，與MCP濃度增加無關；當MCP濃度固定時，線蟲死亡率隨DDVP濃度的增加而增加，可見線蟲死亡率與DDVP、MCP劑量呈依賴性關系。

FH插值分析法求得DDVP和MCP二元混合物聯合作用表達式R(x,y)：

R(x,y)=0.574×10-3/[(x-10)×(y-5)]-0.1305666667×10-2/[(x-10)×(y-10)]+17/{[18000×(x-10)]×(y-20)}-0.1570488889×10-2/[(x-25)×(y-5)]+0.2844266667×10-2/[(x-25)×(y-10)]-1/{[(625×(x-25)]×(y-20)}+1/{[750×(x-50)]×(y-5)}-1/{[500×(x-50)]×(y-10)}+1/{[1500×(x-50)]×(y-20)}/1/{[45000×(x-10)]×(y-5)}-1/{[30000×(x-10)]×(y-10)}+1/{[90000×(x-10)]×(y-20)}-1/{[28125×(x-25)]×(y-5)}+1/{[18750×(x-25)]×(y-10)}-1/{[56250×(x-25)]×(y-20)}+1/{[75000×(x-50)]×(y-5)}-1/{[50000×(x-50)]×(y-10)}+1/{[150000×(x-50)]×(y-20)}。

表2 敵敵畏(DDVP)與久效磷(MCP)聯合作用秀麗隱桿線蟲的死亡率Table 2 Mortality rate of C. elegans induced by mixture of dichlorvos (DDVP) and monocrotophos (MCP)

利用R繪制該混合農藥聯合作用曲面圖，如圖2所示，其中x軸、y軸、z軸分別代表DDVP濃度、MCP濃度和線蟲致死率。該曲面模擬混合農藥整體聯合作用效果，可以內推實驗設計濃度范圍內，DDVP與MCP混合物任一濃度組合下對應的線蟲死亡率。

2.3 農藥混合物聯合毒性評價

在圖1中，選取等高線z= 50%，將等高線與聯合作用效應曲面的交線向下投影，取得混合農藥致50%線蟲死亡時，混合物中DDVP和MCP所有不同濃度組分下聯合作用的觀測等效線(簡稱LC50觀測等效線)，如圖2-b中紅色線段所示。依據等效線圖法，在x軸、y軸上分別標出DDVP、MCP單一作用下LC50及CI，并將各自LC50值、CI上限值、下限值對應連線，劃出50%線蟲致死效應時加和等效線及置信區間。依據等效線圖法評價聯合毒性的原理，從圖2-b可見，混合物LC50觀測等效線在加和等效線置信區間內，因此，判斷兩農藥聯合作用為相加作用。同理，還可作出選取30%、70%線蟲致死效應下混合農藥的觀測等效線(分別簡稱為LC30、LC70觀測等效線)，分別如圖2-a、2-c中紅色線段所示，可見LC30、LC70觀測等效線均在對應效應下的加和等效線置信區間內，故判斷混合物此時致死效應下，兩農藥的聯合作用也為相加作用。

2.4 多元統計分析驗證

使用Bartlett檢驗方法，分別對DDVP和MCP兩因素進行方差齊性檢驗，檢驗結果顯示：DDVP和MCP兩因素方差分析結果均表明處理組數據滿足方差齊性的要求，其中對DDVP方差齊性檢驗P> 0.05(P= 0.1209)，對MCP方差齊性檢驗P> 0.05(P= 0.2017)。方差齊性檢驗后，對DDVP和MCP混合后的致死率進行交互作用的方差分析，如圖3所示，可見各曲線無明顯的相交情況出現，因此認定DDVP和MCP沒有交互作用，表明兩農藥混合后的聯合毒性表現為相加作用。

圖3 DDVP和MCP整體交互效應圖Fig. 3 Diagram of the overall interaction effects of DDVP and MCP

3 討論(Discussion)

Rajini等[26]觀察到DDVP、MCP對秀麗隱桿線蟲的4 h-LC50分別為39 μmol·L-1和16.23 mmol·L-1；Cole等[27]在15種有機磷農藥對秀麗隱桿線蟲的行為毒性研究中，依據行為半數有效濃度結果，發現DDVP毒性大于MCP毒性，上述研究結果與本試驗結果基本一致。

等效線圖法是研究2種化學物質相互作用的經典方法，同時也是充分得到數學證明的一種評價化學物質相互作用的方法，在毒理學及藥理學都得到廣泛的應用。研究者通常采用等毒配比某一濃度下聯合作用的交點與CA加和線(一般選擇50%效應)的位置關系判斷2種化學物質的聯合作用。在實驗設計中，本研究依據單一農藥的急性毒理學實驗結果，由低濃度到高濃度各選擇3組，構建3×3矩形數據以滿足基于FH插值法構建聯合作用模型的條件，建立的模型可預測混合物中各組分不同濃度組合達到的效應，從而擺脫等效線圖法中須按照指定條件進行濃度配比要求的約束。本研究利用的新聯合作用模型及等高線獲得二元有機磷農藥混合物聯合作用觀測等效線，參照等效應線圖法判斷聯合作用原理，在二維坐標圖中確定濃度加和線及置信區間，依據混合農藥觀測等效線與加和等效線置信區間的位置關系進行判斷，將混合農藥是否存在拮抗、協同或相加的聯合作用實現可視化表征，清晰、直觀地顯示了聯合作用效果。

當前，隨著試驗方法學的不斷發展，混合物某一效應水平上的毒性數據，如50%效應水平，已不是評估混合毒性的唯一指標，多個效應水平下的評估，方可提高整體聯合毒性評價的準確性。所以，本研究利用求得的混合物聯合作用觀測等效線，實現了對任一聯合作用效果評價的預測分析，如選擇LC30、LC50和LC70觀測等效線，從低效應水平到高效應水平來全面評價DDVP和MCP混合物聯合毒性效應，豐富了等效線圖法的內容及其應用范圍，達到全面評價二元有機磷混合物聯合毒性效應的要求。同時，通過多元統計對整體樣本數據的交互作用分析，證實DDVP和MCP混合物整體聯合作用為相加作用，與等效線圖法分析結果一致，進一步驗證了新模型推導的聯合毒性觀測等效線可正確判斷二元有機磷混合物的聯合作用效果，表明新模型適用于傳統聯合評價方法。

因此，利用FH插值法構建的二元混合物聯合作用效應曲面，可求得混合物任一效應下觀測等效線，不僅可以直觀、簡潔地全面評價二元混合農藥聯合毒性效應，而且可預測任一效應下的混合物中各組分濃度的全部組合，切實提高了分析效率[28]，為幫助選擇適當的混合比例提供參考依據和新的解決方法。另外，對于本方法在其他農藥的二元混合物毒性評價的適用性，筆者也將繼續開展相關實驗進行深入討論研究。