市政污水處理廠二級出水消毒前后對斑馬魚幼魚的毒性

張雅晶，繆恒鋒,2,3,*，張曉夏，阮文權,2,3

1. 江南大學環境與土木工程學院，無錫 214122 2. 江蘇省厭氧生物技術重點實驗室，無錫 214122 3. 江蘇省水處理技術與材料協同創新中心，蘇州 215009

隨著城市化水平的提高和人口數量的增加，生活用水量持續上升，與此同時市政污水總量不斷增加[1]。生物處理可以去除大部分有機物，但在處理過程中會產生腐殖酸、蛋白質和微生物代謝產物(SMPs)等物質，在消毒時與消毒劑反應生成消毒副產物(DBPs)[2]。部分DBPs具有揮發性，可以通過呼吸途徑和皮膚途徑對人體造成影響；排放到自然水體的污水中不易揮發降解的DBPs可能會遷移至飲用水源地，間接對人體造成影響。因此，為了保障人體健康和生態系統安全，對污水中DBPs的毒性特征進行研究成為近年來的熱點。

研究人員利用不同方法對DBPs的毒性進行研究，主要包括遺傳毒性、細胞毒性和生物毒性[3]。羅妮娜[4]研究發現10～100 μg·L-1碘代乙酸急性暴露96 h后，斑馬魚(zebrafish)的肝臟能夠產生氧化應激效應，活性氧物質和脂質過氧化終產物都能夠大量產生，抗氧化功能酶超氧化物歧化酶(SOD)和重要解毒酶谷胱甘肽硫轉移酶(GST)的活性均被明顯誘導。Yang等[5]利用一種海洋動物(Platynereisdumerilii)作為指示生物，研究了17種新興芳香型鹵代DBPs的毒性，研究顯示DBPs的生物毒性大小為新興芳香型DBPs>碘代乙酸>溴代乙酸>氯代乙酸，新興DBPs的毒性遠大于常規DBPs。現階段研究主要集中于單一DBP的毒性，對多種DBPs聯合生物毒性研究較少；但是城市污水中包含多種DBPs，因此對污水廠出水的總DBPs的聯合毒性研究具有重要的實際意義。由于分析檢測手段的限制，目前已檢測到的DBPs約700種，僅占DBPs總量的30.1%[6]，所以對總DBPs的聯合毒性研究是一個難點。da Costa等[7]選用斑馬魚作為指示生物，通過對比污水廠二級出水消毒前后的急性毒性來間接證明DBPs的急性毒性，結果表明經過氯消毒后的二級出水對斑馬魚的急性毒性大大增加。

斑馬魚是國際標準化組織推薦的模式生物，利用斑馬魚進行實驗是監測廢水綜合毒性簡單易行的方法[8]。污染物能夠造成斑馬魚氧化防御系統損傷，可能引起抗氧化酶失活、DNA損傷和細胞損傷[9]。過氧化氫酶(CAT)是抗氧化損傷防御機理中的一種關鍵酶[10]。同時，脂質過氧化產物丙二醛(MDA)含量可間接反映機體自由基水平，是毒性作用和保護作用的綜合反映[11]。污染物對生物的神經毒性作用機制主要是抑制生物體內的乙酰膽堿酯酶(AChE)活性，使AChE失活，引起乙酰膽堿(Ach)代謝紊亂，阻礙神經系統的正常傳導[12-13]。CAT、MDA和AchE作為毒物毒性的生物標志物已廣泛應用于毒理學研究[14]。

本文利用幼年斑馬魚作為模式生物，將其暴露于不同體積分數二級出水和經次氯酸鈉(NaClO)消毒后二級出水中，對比消毒前后污水對斑馬魚的氧化損傷和神經損傷程度；評價消毒后二級出水中總DBPs對斑馬魚的聯合生物毒性，為DBPs的聯合毒性研究提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗生物為幼年斑馬魚，平均體長(1.93±0.2) cm，平均體重(0.25±0.05) g，用曝氣48 h后的自來水馴養2周，水溫為(25±1) ℃，光暗比為12 h:12 h，溶解氧(DO)保持在7.0 mg·L-1以上，馴養期間斑馬魚死亡率小于5%方可用于實驗。馴養期間每天喂食一次，及時清除糞便及食物殘渣。為了防止食物對實驗的影響，實驗前24 h停止喂食，實驗期間不喂食。

實驗用水為無錫某城鎮污水處理廠二級出水，工藝流程為厭/缺/好-膜生物反應器(AAO-MBR)，水質參數見表1。取回的水樣立即用0.45 μm的濾膜過濾，常規指標在24 h內測定完畢。

實驗用Bicinchoninic Acid (BCA)蛋白含量、MDA、CAT、AchE試劑盒購于蘇州科銘生物有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 消毒實驗

選用NaClO作為消毒劑對污水進行消毒，消毒前將NaClO配制成質量濃度為5 g·L-1的儲備液置于棕色瓶中避光待用。消毒實驗在不透光的密封聚乙烯塑料桶中進行。反應溫度為25 ℃；消毒劑投加量為Cl:DOC=5:1，24 h后測定余氯，按照摩爾比120%投加硫代硫酸鈉(Na2S2O3)終止氯化反應。

1.2.2 亞急性毒性實驗

預實驗：設置A、B、C和D四個實驗組，A組實驗用水為未消毒的二級出水；B組實驗用水為消毒后的二級出水；C組為空白對照1，實驗用水為曝氣48 h后的自來水；D組為空白對照2，向曝氣48 h后的自來水中投加與B組一樣劑量的NaClO，反應24 h后測定余氯，然后按照摩爾比120%投加Na2S2O3終止氯化反應，反應后的自來水作為D組實驗用水。每組設置3個平行樣。每組中隨機投入6條幼年斑馬魚，實驗時間為96 h，采用靜態置換法每天定時置換二分之一的實驗用水，每12 h記錄死亡數。96 h后并未觀察到任何一組斑馬魚死亡，因此，消毒前后污水對幼年斑馬魚均無急性毒性。

亞急性毒性實驗：同樣設置A、B、C和D四組，實驗裝置為25 cm×30 cm×40 cm的玻璃魚缸，有效容積25 L。A組實驗用水為二級出水，設置A1、A2和A3實驗組，體積分數分別為25%、50%和100%；B組實驗用水為消毒后的二級出水，設置B1、B2和B3實驗組，體積分數同A組(NaClO投加量按照Cl:DOC=5:1)；C組空白對照1和D組空白對照2實驗用水同預實驗。7個魚缸中每缸隨機投入50條幼年斑馬魚，實驗周期為15 d，采用靜態置換法每天置換二分之一的實驗用水，分別于1 d、2 d、3 d、6 d、10 d和15 d測定斑馬魚體內的BCA蛋白含量、CAT活性、MDA含量和AchE活性。

1.3 測定方法

1.3.1 常規指標測定

1.3.2 消毒副產物測定

本研究對6類DBPs進行了測定。其中三鹵甲烷(THM4)、鹵代酮(CK2)、水合氯醛(CH)、鹵乙腈(HAN4)和三氯硝基甲烷(HNM)用甲基叔丁基醚萃取，根據美國環保署(USEPA)551.1方法測定[19]；鹵乙酸(HAA9)經甲醇衍生化后，根據USEPA552.3方法測定[20]。分析儀器為GC 2010型配備電子捕獲檢測器的氣相色譜儀(GC-ECD)(島津，日本)。總有機鹵素(TOX)采用離子色譜法測定[21]。

1.3.3 CAT酶活、AchE酶活、MDA含量和BCA蛋白質含量測定

表1 二級出水水質參數Table 1 The water quality parameters of effluent

注： SUVA為比紫外吸收值。

Note： DOC stands for dissolved organic carbon; DTN stands for dissolved total nitrogen; SUVA stands for specific ultraviolet absorbance.

每組中取出3條斑馬魚迅速置于冰塊上，待魚死后放入冷生理鹽水中漂洗，濾紙充分吸干水分，稱濕重；按體積比為1:9加入生理鹽水，在冰浴中用勻漿器制成10%的勻漿；勻漿后將勻漿液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱中保存，測試方法采用蘇州科銘生物試劑盒方法。

實驗結果用“平均值±標準差”來表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)進行暴露組與空白對照組之間差異檢驗，不同字母表示不同暴露組的顯著性差異(P<0.05)。

2 結果(Results)

2.1 消毒前后二級出水中DBPs和TOX測定結果

我國生活飲用水衛生標準(GB 5749—2006)規定了THMs、HAAs和CH限值[22]；世界衛生組織(WHO)規定了HANs限值[23]；HNMs雖然沒有限定標準，但被USEPA列入優先控制DBPs的最高等級[24]；鹵代酮(HKs)可以水解生成THMs[25]，所以也被廣泛關注。其中含碳類型消毒副產物(C-DBPs)為HAA9、THM4、HK2和CH；含氮類消毒副產物(N-DBPs)為HAN4和HNM。我國城市污水再生利用景觀環境用水水質(GBT 18919—2002)中規定的總有機鹵(TOX)限值為1 g·L-1。

溶解性有機物(DOM)普遍存在于污水廠二級出水中，在消毒過程中與消毒劑反應生成DBPs類物質。由表2所示，亞急性毒性實驗中B組DBPs和TOX濃度遠高于A組，B1、B2和B3組C-DBPs的濃度分別為(538.09±40.54) μg·L-1、(1 054.84±35.42) μg·L-1和(2 094.07±40.25) μg·L-1，以THMs為主；N-DBPs的濃度分別為(149.45±15.43) μg·L-1、(273.71±25.12) μg·L-1和(510.04±40.26) μg·L-1，以HANs為主，雖然N-DBPs低于C-DBPs，但由于N-DBPs毒性較高[26]，應引起重視。因為二級出水中DBPs種類繁多，所以本文測定了TOX，有研究發現TOX和DBPs有很好的相關性，TOX可以代表鹵代DBPs的整體情況[27]。A1、A2和A3組TOX濃度分別(0.14±0.03)×106μg·L-1、(0.23±0.04)×106μg·L-1和(0.51±0.07)×106μg·L-1，均低于國家再生水利用景觀環境用水水質標準；但B1、B2和B3組TOX濃度分別為(9.33±0.75)×106μg·L-1、(14.24±0.92)×106μg·L-1和(32.73±1.28)×106μg·L-1，遠超過城市污水再生利用標準。

表2 消毒前后二級出水中消毒副產物(DBPs)和總有機鹵(TOX)含量Table 2 The concentrations of disinfection byproducts (DBPs) and total organic halogen (TOX) in chlorinated and non-chlorinated effluents

注：C-DBPs、HAAs、THMs、HKs、CH表示含碳消毒副產物、氯乙酸、三鹵甲烷、鹵代酮、水合氯醛；N-DBPs、HANs、HNM表示含氮消毒副產物、鹵代乙腈、三氯硝基甲烷；TOX表示總有機鹵；A1～A3表示體積分數分別為25%、50%和100%的二級出水；B1～B3表示體積分數分別為25%、50%和100%的消毒后二級出水。

Note： C-DBPs, HAAs, THMs, HKs, CH stand for carbonaceous disinfection byproducts, haloacetic acid, trihalomethane, haloketone, chloral hydrate; N-DBPs, HANs, HNM stand for nitrogenous disinfection by-products, haloacetonitrile, halonitromethane; TOX stands for total organic halogens; A1-A3stand for 25%, 50%, 100% non-chlorinated secondary effluent; B1-B3stand for 25%, 50%, 100% chlorinated secondary effluent.

2.2 消毒前后二級出水的亞急性毒性

2.2.1 消毒前后二級出水對CAT活性的影響

圖1-(1)、(2)和(3)分別為不同體積分數A組和B組斑馬魚體內CAT活性變化情況。由圖1(1)所示，對于低體積分數，A1和B1組暴露前6 d CAT活性被誘導，除2 d和6 d的A1組其他實驗組與空白均有顯著差異；同時對比A1和B1發現，B1組CAT活性高于A1組，除第1天外呈顯著差異，B1平均濃度為63 nmol·min-1·mg-1prot，相比A1高74.22%，可能是由于B組DBPs的存在使毒性強于A組，引起了更強的氧化應激反應；暴露10～15 d，隨著暴露時間的增加斑馬魚體內CAT活性有所下降，15 d時恢復至空白水平。整體來看，低濃度組(A1和B1)CAT活性均呈現先升高后回落至對照水平的趨勢，但是B1組的適應時間更長。由圖1(2)所示，A2、B2組CAT活性不穩定，整體呈現誘導-抑制-誘導-回落的趨勢，前2 d呈現誘導趨勢，無顯著性，平均增幅分別為對照組的72.02%和76.94%；暴露3 d CAT活性被顯著抑制，分別達到最小值5.12 nmol·min-1·mg-1prot和4.46 nmol·min-1·mg-1prot；暴露6 d CAT再次出現波動，呈現顯著的誘導作用；到15 d時CAT活性被顯著抑制，且對比發現B2組CAT活性顯著低于A2組。對于高體積分數A3、B3組，如圖1(3)所示，CAT活性在前10 d呈現誘導趨勢，15 d時CAT活性急劇下降呈顯著抑制作用，在暴露15 d后CAT活性分別為6.302 nmol·min-1·mg-1prot和4.46 nmol·min-1·mg-1prot，抑制率分別為15.56%和40.22%，B3組CAT含量顯著低于A3組，可能是由于該組中DBPs的存在對細胞造成較嚴重的損傷，對斑馬魚的抗氧化酶抑制作用更強。

圖1 消毒前后二級出水對斑馬魚體內CAT活性的影響注：(1)代表體積分數25%的二級出水；(2)代表體積分數50%的二級出水；(3)代表體積分數100%的二級出水；不同字母表示不同暴露組的顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Effect of chlorinated and non-chlorinated effluent on CAT activity of zebrafishNote: (1) stands for 25% effluent group; (2) stands for 50% effluent group; (3) stands for 100% effluent group; different letters above columns indicate significant differences at P< 0.05 level.

在暴露1～10 d，不同體積分數組間的CAT活性規律性不強，主要是由于斑馬魚在對污染物質造成的氧化壓力進行自我調節，當暴露時間達到15 d時，A組CAT在空白水平，可能是消毒前污水未對斑馬魚的抗氧化防御系統造成不可逆的損傷；但B組CAT均被顯著抑制，說明DBPs在斑馬魚體內的積累導致抗氧化系統的不可逆損傷，其中B1、B2、B3三組相比A組的抑制率((CATA- CAT空白1)-(CATB- CAT空白2)/(CATA-CAT空白1))分別為4.15%、24.87%和31.03%；DBPs分別為693.64 μg·L-1、1 354.27 μg·L-1和2 547.83 μg·L-1；TOX分別為(9.33±0.75)×106μg·L-1、(14.24±0.92)×106μg·L-1、(32.73±1.28)×106μg·L-1；DBPs濃度、TOX濃度與CAT活性的抑制率呈正相關，相關性系數分別為0.796和0.676。

2.2.2 消毒前后二級出水對MDA含量的影響

圖2-(1)、(2)和(3)分別為不同體積分數A組和B組斑馬魚體內MDA含量的變化情況。如圖所示，不同體積分數暴露下，斑馬魚體內的MDA含量均表現誘導-抑制-誘導趨勢。在暴露1 d后，A和B兩組斑馬魚體內的MDA含量均高于空白，呈顯著差異，并且A2、A3組MDA含量顯著高于B2、B3組，可能是A組斑馬魚抗氧化防御系統未被全部激活，自由基未被及時清除。暴露2 d時，A和B組中MDA含量相比第1天均有所降低，A組下降較多，A1、A2和A3分別下降30.56%、15.15%和39.33%；和B1、B2和B3分別下降3.52%、14.26%和4.07%，可能是污水消毒中生成了DBPs，A組毒性低于B組。暴露3～6 d時，除第6天A1組外MDA含量均低于對照，但整體上維持在對照水平，可能是污染物未對斑馬魚造成不可逆損傷，在自身調節范圍內。在暴露10～15 d時，A、B組的MDA含量較對照組高，除第10天B2組外差異均顯著，并隨著時間的增加而增加。另外，B組MDA含量均顯著高于A組，在暴露10 d時，B1、B2和B3中MDA含量分別為0.468 nmol·mg-1prot、0.609 nmol·mg-1prot和0.708 nmol·mg-1prot，相比A1、A2和A3分別高9.36%、61.76%和26.38%；暴露15 d時，B1、B2和B3中MDA含量分別為0.506 nmol·mg-1prot、0.660 nmol·mg-1prot和0.728 nmol·mg-1prot，相比A1、A2和A3分別高28.21%、73.74%和14.82%。

圖3 消毒前后二級出水對斑馬魚體內AchE活性的影響注：(1)代表體積分數25%的二級出水；(2)代表體積分數50%的二級出水；(3)代表體積分數100%的二級出水；不同字母表示不同暴露組的顯著性差異 (P<0.05)。Fig. 3 Effect of chlorinated and non-chlorinated effluents on AChE activities of zebrafishNote: (1) stands for 25% effluent group; (2) stands for 50% effluent group; (3) stands for 100% effluent group; different letters above columns indicate significant differences at P< 0.05 level.

對于不同體積分數暴露組，整體來看25%體積分數對斑馬魚體內MDA含量影響較小，說明脂質過氧化損傷較輕；對于50%和100%體積分數，MDA大量生成，說明隨著污水濃度的增加脂質過氧化損傷更為嚴重。

2.2.3 消毒前后二級出水對AchE活性的影響

圖3-(1)、(2)和(3)分別為不同體積分數A組和B組斑馬魚體內AchE活性的變化情況。在暴露1 d時，A組不同體積分數對AchE活性均有誘導作用，A1和A3與空白組1有顯著性差異，其中A1組誘導作用最強，AchE活性達到最大值11.30 nmol·min-1·mg-1prot；但B組AchE活性有輕微抑制，B1、B2和B3分別為7.92 nmol·min-1·mg-1prot，7.01 nmol·min-1·mg-1prot和6.89 nmol·min-1·mg-1prot，相比空白組2抑制率分別為2.76%、13.89%和15.43%。同時根據表2，B1、B2和B3中DBPs濃度和TOX濃度隨著體積分數呈增加趨勢，與抑制率趨勢一致。在暴露2～15 d，A、B組AchE活性繼續被抑制；A組AchE活性在1.32～7.23 nmol·min-1·mg-1prot的范圍內波動，平均值為4.38 nmol·min-1·mg-1prot，B組AchE活性在2.55～5.398 nmol·min-1·mg-1prot的范圍內波動，平均值為3.88 nmol·min-1·mg-1prot，抑制率分別為49.98%和55.69%。

總體來看，對于體積分數25%實驗組AchE活性波動較大，呈現誘導-抑制-升高的趨勢，波動較大；對于50%和100%實驗組，前3 d波動較大，暴露6 d后，B組AchE活性顯著低于A組，可能是由于B組為經消毒后的污水產生了一定濃度的DBPs，加強了AchE酶活的抑制。

3 討論(Discussion)

目前許多研究者已經對不同種類的DBP進行了毒性研究，研究發現二氯乙腈(DCAN)[28]、亞硝胺(NDEA)[29]和2,2-二氯乙酰胺(DCAcAm)[30]均對斑馬魚造成氧化損傷。但對總DBPs的聯合毒性卻鮮有研究。本文在研究消毒前后污水對斑馬魚體抗氧化損傷毒性時發現，A和B實驗組在污水暴露1～2 d CAT活性整體上呈現誘導作用，同時MDA含量相比對照有所增加，可能是由于初期外源污染物脅迫機體產生了氧自由基引起氧化應激反應，抗氧化防御系統被激活，產生抗氧化酶CAT來清除自由基降低氧化損傷，但初期產生抗氧化酶來不足以全部清除氧自由基，所以剩余的氧自由基與脂質發生氧化反應，生成MDA，造成了一定的氧化損傷。并且，A組CAT活性小于B組，但MDA含量高于B組，分析原因是B組消毒時產生的DBPs使斑馬魚產生更為強烈的氧化應激反應，促進CAT的生成從而降低了氧化損傷。但A1和B1實驗組在第2天時MDA含量卻有所降低，由于在低體積分數下，污染物造成的氧化壓力較小，生成的氧自由基較少，可被增加的CAT全部清除，所以并未產生脂質過氧化損傷。暴露3～6 d時氧自由基與抗氧化酶達到動態平衡，并未產生脂質過氧化反應，污染物對斑馬魚的毒性效應仍然在調節范圍內。研究表明多種DBPs可在生物體內積累[28,30]，所以隨著染毒時間的增加，暴露10～15 d時，積累的有毒物質造成的氧化壓力超過了斑馬魚的耐受范圍，氧自由基直接或間接對抗氧化酶造成損傷，抑制其活性，逐漸積累的自由基攻擊細胞內的脂質、蛋白質、核酸等，對細胞造成損傷，表現為CAT活性被顯著抑制，MDA含量大量生成，且消毒后實驗組CAT抑制作用更強，MDA生成量更高。由以上分析可知，消毒后污水造成的氧化損傷更為嚴重。Gong等[31]利用一種海洋生物的胚胎作為模式生物，對市政污水廠出水中一種常見有機物——十二烷基苯磺酸鈉進行消毒，研究消毒前后毒性變化，結果發現消毒后水樣毒性明顯強于未消毒水樣；Yang等[32]、用藻細胞的抑制率檢測3種污水廠消毒前后的毒性變化，結果發現對于淡水二級出水和含鹽二級出水均是消毒后毒性更大，與本研究結果一致。

另外，暴露15 d時B組的抑制率(CATA-CAT空白1)-(CATB-CAT空白2)/(CATA-CAT空白1)與DBPs和TOX呈正相關，相關性系數分別為0.796和0.676，呈現劑量-效應關系。由此可以說明造成消毒后污水更強的抗氧化系統毒性的原因主要是由于消毒過程中生成的DBPs類物質。

有研究表明DBPs對斑馬魚有神經毒性，例如乙酰胺類物質[33]，但對于總DBPs的毒性卻鮮有研究。本文還研究消毒后污水中總DBPs對斑馬魚神經毒性，對AchE活性進行了測定。從亞急性實驗中AchE活性變化情況可以看出，A組不同體積分數對AchE活性表現為誘導-抑制作用，由于實驗初期在外界環境脅迫下，斑馬魚會對外界刺激做出反應以適應環境，引起AchE活性的增強；隨著染毒時間的增加，污染物在斑馬魚體內積累，毒害作用超過其自身調節范圍，對AChE活性表現出抑制效應，且隨著體積分數的增加抑制作用越明顯。但對比B組在整個實驗期間均處在抑制狀態，可能原因是B組中DBPs對斑馬魚有較強的神經毒害作用，在暴露初期就抑制了AchE活性，并在后期活性均顯著低于A組，為A組的88.57%。主要是由于消毒后的二級出水中含有大量的DBPs物質，能夠加劇抑制AchE活性，從而生物體內的乙酰膽堿的含量上升，造成斑馬魚的神經毒性[34]。

致謝：感謝江南大學環境與土木工程學院丁劍楠老師在文章修改中給予的幫助。