五味子酚對心肌成纖維細胞增殖和轉化生長因子β1及Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響*

劉暢，洪蘭，金紅花

（1.延邊大學藥學院 藥劑學教研室，吉林 延吉 133002；2.延邊大學醫學院 生理學教研室，吉林 延吉 133002；3.延邊大學附屬醫院 藥學部，吉林 延吉 133000）

心肌纖維化是多種心臟相關類疾病病情不斷發展所表現的具有共同特性的病理特征，是引起心室重塑的關鍵因素，其主要病理表現有心肌僵硬度增加、心肌收縮力下降、冠狀動脈血流儲備降低，甚至引起惡性心律失常和猝死[1]。近年來，針對心肌纖維化的治療主要以西藥為主，不僅會出現許多不良反應，治療效果還不理想。對心肌纖維化的治療，中國傳統中藥可以通過多種途徑抑制心肌成纖維細胞（cardiacfibroblasts, CFb）增殖及膠原蛋白合成，并且取得了不錯的效果，因此中藥治療心肌纖維化已成為國內外研究熱點之一。

CFb是心臟非心肌細胞的主要組成，具有保護和支持心臟主體結構，協調心肌的舒縮功能，傳達心肌細胞內信息等許多重要作用；CFb同時也是心肌纖維化過程中主要的效應細胞，它不僅自身具有較強的增殖分裂的能力，而且還可以合成分泌基質蛋白，因此在心臟發生心肌纖維化的過程中具有重要作用[2]。當心臟發生病理性病變時，CFb在多種因素的作用下發生增殖，同時還會分泌細胞外基質蛋白從而引起心臟間質纖維膠原大量合成積聚、膠原組成成分與比例發生改變、空間結構排列順序發生紊亂，最終導致心肌纖維化。心肌纖維化的主要表現為細胞外基質發生嚴重失衡，心肌組織結構中膠原纖維大量沉積、膠原蛋白濃度明顯升高，其中主要是Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白顯著增多，因此膠原蛋白過量沉積也是導致心肌纖維化的重要因素之一[3-5]。

血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）是一種很強生物活性物質，是已知的最強縮血管的活性物質之一，其可通過中樞和外周機制，促進全身血管收縮、使血壓升高，還可刺激腎上腺皮質球狀帶合成和分泌醛固酮，醛固酮也是腎素-血管緊張素-醛固酮系統中另一重要生物活性物質，主要功能是調節鈉水重吸收和鉀的排泄。AngⅡ也是目前較公認的促心肌纖維化重要因素，可以引起CFb的增殖及膠原蛋白合成明顯增加導致心肌纖維化。轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）是人體中重要的致纖維化細胞因子，參與調節成纖維細胞的增殖、分化、遷移和細胞外基質的生成[6-7]。

五味子酚（schisanhenol, Sal）是從中藥五味子中提取的一類木脂素，是其主要的活性成分之一。具有降血壓、抗氧化、保肝護肝和免疫調節的作用[8-10]。目前尚未報道sal對AngII誘導的CFb增殖的影響及抗心肌纖維化的研究。因此本實驗研究Sal對AngⅡ誘導的CFb增殖及TGF-β1和Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響，來探討Sal抗心肌纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 出生1～3 d的SD乳鼠，雌雄不限，延邊大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 Sal（購自上海原葉生物科技有限公司，批號為PJ0607SA13），AngⅡ（購自浙江嘉興市雅瑪試劑有限公司，批號為MAYA-CR-5721），胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）購自美國Hyclone公司，Pen-Strep、DMEM培養基、Ⅱ型膠原酶均購自美國Gibco公司，DAPI、BSA、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司，Vimentin抗體、TGF-β1抗體及Collagen I、CollagenⅢ抗體購自英國Abcam公司，FITC的羊抗小鼠IgG抗體、HRP羊抗兔IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，ECL顯色液購自北京康為世紀生物科技有限公司，其他化學試劑為國產分析純。

1.1.3 主要儀器 全波長酶標儀（美國Biotek公司），371型二氧化碳CO2培養箱（美國Thermo公司），Alpha化學發光凝膠分析成像系統（美國Protein Simple公司），U-RFL-T熒光顯微鏡和IX50倒置顯微鏡（日本Olympus公司），X-15離心機（美國Beckman Coulter公司），FD6型生物安全柜（意大利Bioair公司），電泳儀（美國Bio-rad公司），轉膜儀（上海天能科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 CFb的分離與培養 取1～3 d新生SD乳鼠10只，用75%酒精消毒，在無菌條件下開胸取出心臟，置入磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS）中，將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織碎塊，用0.25%膠原蛋白酶在37℃水浴下不斷進行消化，每10 min收集1次消化懸液，共5次。棄第1次的消化懸液，其余每次收集的消化懸液加入等量的含有20%胎牛血清的培養液終止其消化，離心（1 200 r/min，5 min），棄上清液，收集沉淀。再加入含有20%胎牛血清的培養液制備成細胞懸液，接種培養皿中，差速貼壁60 min，去除其他細胞，待細胞成長接近95%時，按1∶3傳代培養，實驗采用2～5代細胞。

1.2.2 CFb的鑒定 將CFb放置在倒置顯微鏡下觀察其生長狀態。取1×105個2代CFb接種于放有無菌蓋玻片的6孔板中，2～3 d后取出，用PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細胞20 min，用PBS洗3次，0.5%聚乙二醇辛基苯基醚破膜20 min，用PBS洗3次，10% BSA封閉2 h，加入Vimentin抗體，4℃過夜。再用PBS洗3次，避光條件下加入標記FITC的山羊抗鼠IgG抗體，室溫放置1 h，最后加入DAPI染細胞核，20 min后置于熒光顯微鏡下、觀察。

1.2.3 MTT法測定CFb的增殖情況 將處在對數生長期的CFb以每孔0.5×104個接種在96孔板中，培養24 h后換無血清培養基，繼續培養24 h后使細胞進入生長靜止期，之后給予相應藥物繼續培養24 h。實驗分組如下：①對照組，無血清的DMEM培養基；②模型組，含AngⅡ 100 nmol/L；③Sal組，含AngⅡ 100 nmol/L的Sal 3個劑量組（100、200及400 μmol/L）。之后每孔加MTT 20 μl（5 mg/ml），培養4 h，棄上清液，每孔加150 μl的DMSO，用酶聯免疫儀在490 nm波長處檢測光密度值（OD值）。細胞抑制率=（模型組OD值-Sal組OD值）/（模型組OD值-對照組OD值）×100%。

1.2.4 Western blot檢測目的蛋白 將CFb接種于6孔板上，培養24 h后按實驗要求加入處理因素，Sal組中Sal濃度分別為200、600及1 000 μmol/L，其他條件不變，處理時間為24 h。收集處理后的CFb，棄培養液，用少量PBS洗1次，每孔100 μl加入RIPA蛋白裂解液，冰上裂解，于4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液，目標蛋白按BCA蛋白試劑盒的說明書操作進行蛋白定量，加入4×上樣緩沖液，100℃加熱3 min使蛋白變性。目標蛋白用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上，選取目標條帶，用5%脫脂奶粉封閉液進行室溫封閉1 h，用PBST洗膜3次，每次10 min，然后分別加入Collagen I抗體、Collagen Ⅲ抗體、TGF-β1抗體，4℃過夜，用PBST洗滌后加入羊抗兔IgG酶標抗體，室溫孵育2 h。分別進行Western blot分析，用ECL化學發光試劑盒顯影，Alpha化學發光凝膠圖像系統分析各蛋白條帶灰度值，并以β-actin為內參標化各樣品蛋白電泳條帶的灰度值。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 19.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，方差分析中的兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CFb形態學觀察

倒置顯微鏡下觀察，CFb的形態獨特，呈長梭形或不規則三角形，細胞的中央有卵圓核，細胞胞質向外伸出突起，有的細胞呈交叉重疊生長，無自發性搏動。見圖1A、B。

2.2 CFb免疫熒光鑒定情況

在熒光顯微鏡下觀察，視野中的細胞綠色部分為Vimentin抗體的顯色，藍色部分為DAPI染色的非特異細胞核分布情況。Vimentin抗體表達陽性的細胞數占總細胞數目的95%以上。見圖2。

圖1 CFb的形態觀察

圖2 CFb免疫熒光鑒定

2.3 Sal對AngⅡ誘導的CFb增殖的影響

MTT法檢測Sal對AngⅡ誘導CFb增殖的影響，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組OD值與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；3個不同劑量Sal組的OD值與模型組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見附表。

2.4 Sal對AngⅡ誘導的CFbⅠ、Ⅲ型膠原蛋白表達的影響

各組的Collagen I表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=163.962，P=0.000），各組的Collagen I表達水平有差異。對照組Collagen I條帶較細，與對照組比較，模型組、AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組的Collagen I灰度值增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；AngⅡ+1000μmol/L Sal組的Collagen I蛋白表達無變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組Collagen I灰度均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

附表 Sal對AngⅡ誘導的CFb增殖的影響 （n =6，±s）

附表 Sal對AngⅡ誘導的CFb增殖的影響 （n =6，±s）

注：1）與對照組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 OD值 抑制率/%對照組 0.225±0.024 -模型組 0.546±0.0291） -Sal組 100 μmol/L 0.491±0.0482） 17.134 Sal組 200 μmol/L 0.438±0.0292） 33.644 Sal組 400 μmol/L 0.345±0.0222） 62.617 F值 131.365 P值 0.000

各組的Collagen Ⅲ表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=159.517，P=0.000），各組的Collagen Ⅲ表達水平有差異。對照組Collagen Ⅲ條帶較細，與對照組比較，模型組、AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ灰度值增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；AngⅡ+1000μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ蛋白表達無變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組的Collagen Ⅲ灰度均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

2.5 Sal對AngⅡ誘導的CFb TGF-β1蛋白表達的影響

圖3 Sal對AngⅡ誘導的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達的影響 （n =6，±s）

各組的TGF-β1表達水平，經單因素方差分析，差異有統計學意義（F=241.489，P=0.000），各組的TGF-β1表達水平有差異。對照組TGF-β1條帶較細，與對照組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ +600μmol/L Sal組、AngⅡ +1000μmol/L Sal組的TGF-β1灰度值增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；AngⅡ +1000μmol/L Sal組中 TGF-β1蛋白表達無變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，AngⅡ+200μmol/L Sal組、AngⅡ+600μmol/L Sal組、AngⅡ+1000μmol/L Sal組TGF-β1灰度均降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 Sal對AngⅡ誘導的TGF-β1蛋白表達的影響（n =6，±s）

3 討論

心肌纖維化是心臟發生病理性病變時，心臟間質中的CFb過度增殖分化，細胞外基質膠原過度聚積及膠原蛋白比例失衡為特征的心臟間質重構。其中CFb對心肌纖維化有重要作用，主要通過其增殖分化成為肌成纖維細胞、分泌多種生物活性因子及細胞外基質而引起心肌纖維化。在此過程中，多種因素參與了CFb功能的調節。

在倒置顯微鏡下筆者發現，細胞呈長梭形或不規則三角形，中央有卵圓核，此形態為CFb特有形態。Vimentin是鑒定成纖維細胞的主要生物標志物；Vimentin抗體的陽性表達在圖中顯色成綠色，非特異性細胞核染色為藍色，經觀察CFb細胞數占總細胞數的95%以上，證實本實驗分離的細胞為純化的CFb。

本MMT實驗結果顯示，與對照組比較，模型組平均OD值增加，差異有統計學意義。說明AngⅡ作為公認的促心肌纖維化生物因子，濃度為100 nmol/L時可以促進CFb增殖。Sal各劑量組對AngⅡ所致的CFb增殖均有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。

CFb分泌的細胞外基質主要由膠原、糖蛋白、蛋白酶、細胞因子及生長因子等構成。其中的膠原主要是Ⅰ型和Ⅲ型，分別約占80%和10%，主要功能是支撐心臟整體骨架、傳遞信號到心肌細胞、調節心臟有規律收縮[11]。本結果顯示，與對照組比較，藥物處理24 h后，模型組的Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達量增加。說明100 nmol/L的AngⅡ不僅可以促進CFb的增殖，還可以促進由CFb分泌的細胞外基質中的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白合成。在Sal組中，不同濃度的Sal能抑制AngⅡ誘導后的CFb中Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白的表達；此外還發現，Collagen I、Collagen Ⅲ蛋白表達的變化趨勢與其有一定的相關性。說明Sal可以抑制AngⅡ誘導后CFb分泌的細胞外基質中的膠原蛋白合成。

TGF-β1是一組調節細胞生長和分化的細胞因子，它不僅參與正常機體組織代謝和功能維持，還在多種疾病病理生理過程中發揮重要作用。同時TGF-β1又是一類多效應的細胞因子，可以促進心臟成纖維細胞的增殖、分化；促進合成膠原蛋白的合成；抑制膠原的降解，同時對膠原酶原、基質酶原等產生抑制作用[12-13]。本研究發現，在藥物處理24 h后，模型組中TGF-β1蛋白表達升高。說明在CFb中AngⅡ可以促進TGF-β1蛋白表達，而且TGF-β1蛋白量增加與CFb的增殖及膠原蛋白合成有關。初步證實TGF-β1相關信號通路參與了AngⅡ誘導新生大鼠心臟纖維化的過程。Sal可以下調AngⅡ誘導后CFb中TGF-β1蛋白表達且呈一定的劑量依賴性。

筆者通過以上研究發現，在AngⅡ誘導下，CFb中的TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白表達升高，其作用機制可能是AngⅡ誘導CFb合成TGF-β1，生成的TGF-β1反過來刺激CFb合成Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白，大量的CFb增殖及細胞外基質堆積導致心肌纖維化。在Sal干預的蛋白表達中，TGF-β1、ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白降低且表達呈正相關。因此TGF-β1與ColleageⅠ、Collagen Ⅲ蛋白之間存在著相互調節關系。提示Sal對AngⅡ誘導CFb的增殖及Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的抑制作用部分是通過下調TGF-β1蛋白表達而實現的。

綜上所述，Sal能抑制CFb增殖及降低Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達，而起到了抗心肌纖維化的作用，其機制可能與下調TGF-β1蛋白表達有關。阻斷TGF-β1有可能成為預防和逆轉心肌纖維化的一個重要靶點。