老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a、-200b水平及臨床意義

周冬冬 劉晶晶 史振東 楊茜曦 張 瑾

(天津醫科大學腫瘤醫院乳腺三科，天津 300060)

三陰性乳腺癌既不表達雌激素和孕激素受體，也不表達人表皮生長因子受體-2，是乳腺癌的一個特殊亞型，占乳腺癌的10%～20%，具有惡性程度更高、侵襲能力更強、預后更差的特點，且對人表皮生長因子受體-2的曲妥珠單抗分子的靶向治療無效〔1，2〕。微小RNAs(miRNAs)是一類非編碼單鏈的小分子RNA，能夠通過與目標mRNA結合直接降解mRNA或抑制其翻譯等機制發揮調控細胞發育、增殖等功能，在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用〔3，4〕。miR-21、-200a、-200b均是調控細胞發育、增殖的重要miRNAs，但目前有關三者血清水平在老年三陰性乳腺癌中臨床意義的報道較少。本研究通過探討血清miR-21、-200a、-200b水平在老年三陰性乳腺癌患者中的臨床意義，為其診療提供參考。

1 對象與方法

1.1對象 2014年1月至2017年12月天津醫科大學腫瘤醫院接受治療的80例經病理學確診為乳腺癌(雌激素和孕激素受體及人表皮生長因子受體-2表達均陰性)、年齡60～78歲、平均(65.3±7.6)歲的老年三陰性乳腺癌患者為觀察組，同時選擇50名年齡60～76歲、平均(66.2±8.4)歲的健康體檢者為對照組。觀察組浸潤性導管癌52例、浸潤性導管癌28例。

1.2主要試劑與儀器 Trizol試劑盒、miRNA反轉錄試劑盒及熒光實時定量試劑盒分別購于美國Invitrogen公司、德國QIAGEN公司和日本Takara公司；miR-21引物：5′-tagcttatcagactgatgttga-3′；miR-200a引物：5′-taacactgtctggtaacgatgt-3′-miR-200b引物：5′-taatactgcctggtaatgatga-3′、下游通用引物和內參U6引物均由試劑盒提供。紫外分光光度計Ultrospec與熒光實時定量儀分別購于美國GE Healtbcare公司和BioRad公司。

1.3RNA的提取 于清晨抽取兩組對象靜脈血5 ml，離心，分離血清，按照Trizol試劑盒說明書提取RNA：取0.5 ml分離好的血清，加入0.5 ml Trizol，于室溫下靜置10 min；加入0.5 ml氯仿，混勻，于低溫下12 000 r/min離心10 min，吸取上層透明液體，加入0.75倍上層液體量的異丙醇，混勻后，于低溫下12 000 r/min離心10 min，沉淀加入1.0 ml乙醇洗滌后，于低溫下12 000 r/min離心5 min，置室溫下干燥15 min；加入無RNA酶的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，用紫外分光光度計進行定量后，保存于-80℃冰箱。

1.4miRNA cDNA反轉錄及熒光實時定量 按照試劑盒說明書進行操作：取出提取好的RNA，配制成體積為20 μl的反應體系；反應條件為：37℃反轉錄反應60 min，95℃滅活反應5 min；取出反轉錄產物，配制成體積為20 μl的反應體系，將其放置于熒光定量儀中進行反應，95℃預變性反應15 min，94℃變性反應15 s，55℃退火反應30 s，70℃延伸反應30 s，40個循環。用2-△ct計算相對表達量。

1.5統計學分析 采用統計學軟件SPSS19.0進行t檢驗。

2 結 果

2.1兩組血清miR-21、-200a和-200b水平的比較 與對照組比較，觀察組血清miR-21、-200a水平顯著升高，miR-200b水平降低(P均<0.01)，見表1。

表1 兩組血清miR-21、-200a和-200b水平的比較相對表達量)

2.2不同臨床病理特征老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比較 與中、高度分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結轉移的老年三陰性乳腺癌患者比較，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結轉移的老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a水平顯著升高，miR-200b水平顯著降低(P均<0.01)，見表2。

表2 不同臨床病理特征老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a和-200b水平的比較相對表達量)

3 討 論

因三陰性乳腺癌惡性程度高、侵襲能力強、預后差，因此給女性健康及生命帶來了嚴重的威脅〔5，6〕，早期發現、早期治療對其預后具有重要意義。目前，miRNAs在調控腫瘤發生、發展和預后方面的作用已經得到證實〔7〕，是腫瘤研究的熱點之一。miR-21是在人體組織和細胞中較早發現的微小RNA分子，由單個基因編碼，在多種非實體瘤(如淋巴瘤等)和實體瘤(如胃癌、肝癌、肺癌等)腫瘤組織中高水平表達，是第一個在腫瘤患者血清中檢測到的微小RNA分子，其可以通過抑制程序性細胞死亡基因(PDCD)4、原肌球蛋白1基因(TPM1)、磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)、轉錄激活基因(TAP)63等腫瘤抑制基因表達而促進腫瘤細胞的增殖，并與腫瘤的侵襲、轉移等病理過程密切相關〔8，9〕。李強等〔10〕研究顯示，高水平表達的miR-21會降低腫瘤化療的敏感性，增加耐藥性；而抑制miR-21的表達，能夠逆轉化療藥物耐藥性，提高化療效果。miR-200a是miR-200家族中的成員之一，其在卵巢癌、胰腺癌等腫瘤組織中高水平表達，被認為是上皮細胞分化和上皮間質轉化過程中的關鍵調控因子，與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關〔11，12〕。miR-200b是miR-200家族中研究較多的一個微小RNA分子，在多種腫瘤中表現出一定的抗腫瘤作用，而且能夠抑制腫瘤的侵襲轉移〔13，14〕。陳志凱等〔15〕研究發現，胃癌患者血清miR-200b水平顯著降低，并與腫瘤的臨床分期及淋巴結轉移相關，有助于判斷疾病的預后。

本研究結果表明老年三陰性乳腺癌患者血清miR-21、-200a及-200b水平的高低與腫瘤分化程度、臨床分期、淋巴結轉移密切相關，均可作為三陰性乳腺癌嚴重程度及預后的判斷指標，為其診療提供參考。