食蟹猴自發性膝骨關節炎模型的中藥干預實驗

陳巧玉 扶世杰

(西南醫科大學，四川 瀘州 646000)

近年來，中醫藥在膝骨關節炎(KOA)的治療中取得較大進展。獨活寄生湯具有祛風濕、止痹痛、益肝腎、補氣血之功。近年來，該方劑在骨關節炎(OA)的治療上逐漸受到關注。目前還沒有任何藥物可以使OA的病情逆轉或停止〔1〕，對于KOA軟骨組織作用的有效靶點和部位也尚不明確，這可能源于OA中存在更多的各種致病因子及其相關因子、動物模型與人類基因的差異等因素。本文選用與人類基因型和行走方式非常類似的食蟹猴，構建自發性KOA動物模型，以痹證論治KOA理論為依據，采用獨活寄生湯進行藥物干預，探討其治療的有效靶點和部位，為進一步藥物治療的療效檢驗及安全性評估提供可靠保證。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級青年型(正常膝關節，年齡3～5歲)和老年型食蟹猴(自發性KOA，年齡≥20歲)各6只，體重4～6 kg，由云南靈長類實驗動物有限公司提供。12只食蟹猴適應性喂養2 w，自然光照，溫度16～26℃；給予充足的食物和潔靜水，允許其自由活動。老年型以生理鹽水熱敷6 w，隨機分為空白對照組和干預組，每組3只；干預組以獨活寄生湯熱敷6 w。實驗過程符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規定。

1.2主要實驗試劑 PV9000試劑盒、二氨基聯苯胺(DAB)顯色液、TritonX-100、Tween 20，轉化生長因子(TGF)-β1抗體(Santa cruz 1∶100)，氯化鈉(NaCl)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、多聚甲醛、鹽酸(HCl)、氫氧化鈉(NaOH)、乙醇、二甲苯、中性樹膠、脫鈣液、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、檸檬酸鹽緩沖液(粉劑，2 000 ml/袋)、封閉用正常羊血清。

1.3主要實驗儀器 超凈工作臺、離心機、隔水式電熱37℃恒溫培養箱、超低溫冰箱、電熱恒溫水浴鍋、快速混勻器、電子天平、顯微鏡等。

1.4實驗藥物 獨活寄生湯由西南醫科大學附屬中醫醫院藥劑科提供，藥物組成：獨活20 g、桑寄生20 g、杜仲20 g、牛膝20 g、秦艽15 g、防風12 g、細辛6 g、桂心12 g、茯苓20 g、當歸12 g、熟地12 g、川芎12 g、路路通15 g、海桐皮15 g、伸筋草15 g、桃仁12 g、紅花12 g、丁香15 g、甘草6 g。

1.5標本采集及效應指標測定 將各組食蟹猴仰臥捆綁于動物手術臺上，股動脈取血 3 ml置于5 ml試管中，在37℃溫箱中溫浴0.5～1.0 h后以3 000 r/min離心15 min，然后取血清1 ml置于-20℃冰箱保存。抽取各組食蟹猴右側膝關節沖洗液(無菌蒸餾水沖洗) 1 ml，肉眼觀察關節液性狀，包括顏色、透明度和黏稠度，然后以3 000 r/min離心15 min，取上清液置于-20℃冰箱保存。待所有標本采集完畢后，采用酶聯免疫吸附試驗檢測血清白細胞(WBC)、紅細胞沉降率、C反應蛋白(CRP)、關節液腫瘤壞死因子(TNF)-α含量，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行。

1.6統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1青年型和老年型退變膝關節比較 青年型關節液性狀透明、清亮、黏稠度中；老年型關節液顏色較深、清亮、黏稠度更高。老年型關節液TNF-α、CRP和紅細胞沉降率顯著高于青年型(P=0.000)，見表1。

2.2空白對照組與干預組關節液性狀變化 與空白對照組(關節液黃、清亮、黏稠度高)相比，干預組干預2 w無明顯變化；干預4 w，顏色由黃變為淡黃，黏稠度改變不明顯；干預6 w，黏稠度稍有降低。

2.3空白對照組與干預組關節液TNF-α、WBC、紅細胞沉降率、CRP含量比較 與空白對照組比較，干預組干預2、4、6 w TNF-α含量明顯降低(P=0.000)；WBC、紅細胞沉降率含量變化不明顯(P>0.05);干預2、4、6 w，干預組CRP含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

與青年型比較：1)P=0.000

表2 干預前后各組關節液TNF-α、WBC、紅細胞沉降率、CRP含量比較

3 討 論

研究發現，食蟹猴自發性OA模型的流行病學和關節病理學改變與人相似〔2～4〕；其關節的大小適中，不但可以滿足對于生物化學指標的采集，也能滿足放射學和組織學研究。隨著年齡老化，會出現典型的OA改變〔5〕；與本實驗結果相符。此外，此類動物有較長的生命跨度，是人類慢性疾病的最佳實驗材料之一〔6〕。選用食蟹猴自發性KOA 模型能夠避免由于人工誘導的OA，更有效地模擬人類KOA發生發展過程，在關節軟骨生化改變、OA發病機制、尤其在療效比較等方面的優勢明顯。參照《獸醫臨床病理學 》〔6〕，一般情況下，健康動物的關節液呈無色至淡黃色，澄清透明，含有黏蛋白，故較為黏稠。臨床上一般通過主觀印象判斷。當出現炎癥時，由于細胞數和纖維蛋白原含量增加，則出現不同程度的混濁，主觀上也可表現為關節液顏色變深；而炎癥時透明質酸酶下降導致黏蛋白降解，或因關節液量增多，黏蛋白被稀釋可導致黏稠度降低。本實驗結果提示，獨活寄生湯干預可能減輕因炎癥引起的關節液細胞數量增多而導致的混濁，但對于與透明質酸質量相關的關節液黏稠度改變不明顯。

研究表明，在KOA患者關節滑液中TNF-α水平增加，參與了關節局部炎癥反應；不僅在OA患者，正常軟骨細胞采用TNF-α刺激，其基質金屬蛋白酶(MMP)-1、3 mRNA和基質金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)-1的表達明顯上調〔7〕。TNF-α可通過多途徑參與OA，如經典的細胞凋亡途徑、MMPs介導的軟骨細胞外基質降解，對Ⅱ/Ⅰ型膠原蛋白的誘導分化導致的軟骨基質降解。Guo等〔8〕研究發現內質網應激相關分子在OA患者的活性，特別是XBP1S片段在TNF-α處理后表達顯著增加。這種聯系可能為OA提供新的治療途徑。最新細胞模型和動物實驗發現，OA與糖酵解代謝紊亂之間存在一定關系〔9，10〕，6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-二磷酸酶(PFKFB)3在OA軟骨中調節糖酵解作用的表達變化〔11〕，發現PFKFB3在OA軟骨組織或TNF-α刺激軟骨細胞時的表達下調。OA炎癥與這些內源性途徑之間存在的關系，可能為OA提供一個潛在的預防或治療靶點。

在自發性KOA中，患者關節液的WBC常見增高，但外周血WBC改變并不明顯。可能是源于自發性KOA的炎癥絕大多數屬于無菌性炎癥。除外合并類風濕關節炎或其他感染性疾病時，可見全血WBC和紅細胞沉降率的異常。本實驗中，獨活寄生湯干預對模型組的全血WBC和紅細胞沉降率影響并不明顯；從藥物治療的效果來看，隨著時間延長，并未呈現降低趨勢。這也可能與實驗動物模型個體間本身的差異有關。總體說來，全血WBC和紅細胞沉降率對于自發性OA的診斷價值有限，但可作為關節炎鑒別診斷和療效判斷的指標之一。

CRP是在感染和組織損傷時血漿濃度快速、急劇升高的主要急性炎相期蛋白。傳統觀點認為CRP為非特異性的炎癥標志物，常作為反映類風濕關節炎療效的指標。其與風濕性關節炎病情及骨質破壞的發生和發展呈正相關。但在OA診斷中，CRP的檢測意義往往并不具特異性，而常被作為療效判斷的指標之一。一份關于KOA疼痛患者CRP變化的回顧調查結果顯示，在1 156例檢測CRP的患者中，CRP異常者占5.5%(64例)，檢測的834例患者中，異常者占23.14%(193例)〔12〕。CRP雖不能作為診斷OA的特異性指標，但對于炎癥嚴重者及OA合并類風濕關節炎或伴隨其他感染性疾病的鑒別診斷，其檢測具有重要參考價值。

隨著檢測技術的不斷發展，臨床上可以用新的敏感方法檢測出低濃度CRP，稱為高敏CRP (hs-CRP)。目前，hs-CRP 已被證實是由細胞因子尤其是白細胞介素(IL)-6 刺激而產生，與慢性低水平活動的細胞因子相關，是慢性炎癥引發心血管疾病的獨立危險因素〔13，14〕。一項對大樣本的中老年人群(包括健康人群、OA早期患者)血漿hs-CRP水平的檢測結果顯示，OA組明顯高于對照組，與炎癥程度正相關，說明OA患者在早期有炎癥存在〔15〕。另有對比研究發現，處于KOA活動期表現為關節疼痛的患者，其血漿hs-CRP水平明顯高于放射學(無癥狀)的KOA患者，且后者血清hs-CRP水平高于正常對照組〔16〕。hs-CRP在OA早期階段可能具有診斷意義，有望成為OA的常規檢測手段。但hs-CRP參與OA具體機制尚不清楚。國外有研究認為，hs-CRP 可能誘導了IL-6的分泌，激活巨噬細胞表達細胞因子，也可能放大了其他介質的炎癥前作用〔17，18〕。

最新關于獨活寄生湯治療OA的Meta分析顯示，該方劑可改善KOA患者的臨床癥狀，緩解患者疼痛，其療效優于西醫治療〔19，20〕。但具體的作用機制與途徑還不十分清楚；在臨床長期持續的療效方面還有待驗證；對于不同人群存在療效差異，也還缺乏較充分的臨床研究數據。本研究結果顯示，獨活寄生湯干預對食蟹猴自發性KOA關節液TNF-α有直接抑制作用，能夠降低全血WBC及CRP水平。

此外，最新研究發現的一些與OA疾病嚴重程度相關的潛在生物標志物，如：血清和滑膜中抵抗素〔21〕、Ihh〔22〕、Toll樣受體〔23〕；與軟骨修復和重塑相關的干細胞或祖細胞(CSPCs)〔24〕，一些軟骨基質蛋白酶，如軟骨蛋白激酶B(Akt)、蛋白激酶(PK)Cα也參與了OA的進展〔25〕。其復雜的相互作用，獨活寄生湯與其是否有作用及其機制，有待進一步探索。