hENT1單核苷酸多態性與接受含吉西他濱方案非小細胞肺癌患者療效的關系

吳風雷 宋子琰 劉 毅 鄭義同 卞保祥

(徐州醫科大學附屬連云港醫院，江蘇 連云港 221002)

最新的數據統計表明，肺癌在所有的惡性腫瘤中發病率最高〔1〕，其中大部分(約80%)病理類型為非小細胞肺癌；而且絕大部分患者一經診斷就是晚期，失去手術機會。化療是晚期非小細胞肺癌治療的基本手段，但5年生存率也只有15%左右〔2〕，臨床上經常會遇到不同非小細胞肺癌患者接受同一種方案化療，但療效卻相差甚遠。單核苷酸多態性(SNP)指DNA序列上發生的單個核苷酸堿基之間的變異。這種遺傳多態性可導致基因組編碼的相應蛋白結構和功能發生改變，從而導致不同個體對疾病的易感性及藥物的療效差異〔3〕。SNP的這種特點決定了它能夠應用于腫瘤的治療和預后等有關研究。因此，檢測某些特定基因特定位點的SNP，觀察其在不同個體或人群中基因序列上的差異，可用來提前預測惡性腫瘤患者對不同化療藥物的療效，使精準個體化化療成為可能。

吉西他濱屬核苷類藥物，是第三代抗腫瘤化療藥物，對腫瘤細胞的DNA合成期(S期)產生作用，也可阻滯腫瘤細胞從合成前期(G1期)向合成期甚至合成后期(G2期)發展。該藥物需通過細胞膜上的載體將其轉運至胞內，其中最重要的載體是人類平衡型核苷轉運蛋白(hENT)1。已有研究表明在實體腫瘤患者中，hENT1(-706)GC基因型與GG基因型相比，前者能降低10%的吉西他濱體內清除率〔4〕。本研究探討 hENT1(-706)SNP與含吉西他濱為主的化療方案對非小細胞肺癌患者療效間的關系，為指導臨床個體化精準治療提供一定的生物預測標志。

1 資料與方法

1.1一般資料 2009年1月至2012年12月共納入連云港第一醫院腫瘤科和淮安市第一人民醫院的225例非小細胞肺癌患者，其中男性146例，女性79例，年齡33～79歲，平均55歲；鱗癌120例，腺癌105例；高分化61例，中分化82例，低分化82例。ⅢA期126例，ⅢB期87例，Ⅳ期12例，其中hENT1(-706)位點GG基因型124，GC基因型90例，CC基因型11例。患者均配合良好，取得準確數據。

1.2化療方案及評價標準 所有患者接受以下的化療方案：吉西他濱劑量及用法：1 000 mg/m2，用藥時間為化療開始的第1和第8天。順鉑劑量及用法：一次40 mg/m2，連用3 d，第2～4天給藥。卡鉑：曲線下面積(AUC=4～5 mg·ml-1·min-1)，第1天，21 d為1個周期。以實體瘤療效評價標準評價療效：完全緩解(CR)：病灶完全消失4 w以上；部分緩解(PR)：單個病灶或多個病灶的長徑總和縮小超過50%超過4 w以上；進展(PD)；出現新病灶，單個病灶或多個病灶的長徑總和增大超過20%；穩定(SD)：單個病灶或多個病灶的長徑總和縮小介于PR和PD之間，通過客觀緩解率(ORR)CR+PR的總例數和總生存期(OS)即從患者開始接受化療的日期至患者最終死亡的日期作為觀察指標評價化療療效。

1.3基因組DNA提取 所有患者化療前抽取靜脈外周血2 ml。采用Dneasy?blood&tissue 試劑盒(Qiagen，Hiden，Germany)提取外周血基因組DNA，-20℃冷藏備用。

1.4PCR擴增目的基因并對目的位點進行測序 hENT1 G-706C的引物為：正義5′-GGGAGCAGGAGAGGGACGCT-3′，反義3′-AGGCAGGCAAGAGGACGAGAGG-5′，反應體系總體積為30 μl，包括模板1 μl，10×緩沖液3 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，rTAq酶0.5 μl，正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl。擴增條件為：變性：95℃30 s，退火：56℃30 s，延伸：72℃30 s，總共35個循環，PCR擴增產物送上海歐易科技有限公司在Biosystems DNA測序儀進行單向測序。

1.5統計學應用 采用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、非條件Logistic回歸分析、Kaplan-Meier分析、Log-rank檢驗、Cox比例風險回歸模型。

2 結 果

2.1hENT1(-706)基因多態性和化療療效之間的關系 肺癌患者ORR與其hENT1(-706)位點SNP相關(P<0.05)，hENT1(-706)GG 基因型的患者ORR明顯高于GC或CC基因型(圖1，表1)。

圖1 hENT1G-706C位點基因測序

表1 化療敏感性和hENT1G-706C 位點基因多態性之間的關系

1)非條件Logistic回歸校正了年齡、性別、美國東部腫瘤協作組評分、分期、分級

2.2hENT1(-706)基因多態性和OS之間的關系 攜帶hENT1(-706)OS：GG 為19.0個月，GC為 15.7個月，CC為14.5個月，GG與GC，CC比較差異具有統計學意義(P<0.001)，GC，CC比較差異無統計學意義(圖2)。將hENT1(-706)GC和CC基因型合并，與GG型比較，生存時間顯著減少(P<0.001)(表2，圖3)。將臨床病理等相關的因素與基因型之間的聯系通過Cox 回歸模型(單因素及多因素)分析顯示，基因分型、臨床分期及分化程度與OS相關。攜帶hENT1(-706)GC或CC基因型的患者死亡風險明顯高于GG

基因型的患者(P<0.05)(表3)。

表2 hENT1(-706)基因多態性和OS之間的關系

圖2 hENT1(-706)GG，GC，CC基因型NSCLC患者的總生存曲線

表3 晚期NSCLC預后影響因素的Cox多因素回歸分析結果

HR風險比，HR>1 表明OS時間短;1)OR通過單變量非條件COX回歸分析;2)OR通過多變量非條件COX回歸分析

圖3 hENT1(-706)GG，GC+CC基因型NSCLC患者的總生存曲線

3 討 論

化療是目前NSCLC患者綜合治療的重要手段之一。但是，不同患者即使接受了相同的化療方案，療效或不良反應可能會存在很大的差異。近年來，越來越多的研究表明藥物相關酶基因SNP和化療藥物敏感性密切相關。

吉西他濱是親水性化療藥物，需要通過相應的核苷載體才能進入腫瘤細胞發揮藥效。目前已經被確認總共有5種核苷轉運載體和吉西他濱轉運有關：人富集型核苷轉運蛋白(hCNT)1-3和hENT1-2。其中hENT1的轉運作用最重要〔5〕。hENT1缺乏的腫瘤細胞對核苷類藥物耐藥〔4〕。Wei等〔6〕通過納入10項研究對399例接受吉西他濱治療的胰腺癌患者進行Meta分析發現：hENT1預測是吉西他濱療效的生物靶標。Deng等〔7〕發現hENT1高表達的晚期膽道癌患者接受含有吉西他濱方案的化療效果要優于低表達的患者。Elebro等〔8〕建立肺癌組織塊活體移植動物模型發現，吉西他濱對hENT1陽性表達的負瘤裸鼠總生存時間明顯長于對照組。已有研究表明攜帶hENT1 mRNA高表達患者中大部分單倍體型為CGG，CGC〔9〕。因此，hENT1 SNP與吉西他濱藥物敏感性相關很有可能是改變了hENT1表達水平所致，接下來的研究將檢測患者hENT1基因及蛋白表達，對其可能的機制進一步闡明。Myers等〔9〕發現hENT1-1345C>G、-1050G>A和-706G>C 3位點的基因多態性影響hENT1蛋白表達，而hENT1CGG/CGG野生型單倍體型和CGG/CGC突變型單倍體型主要的變異位點是-706G>C。推測hENT1-706G>C位點基因多態性在影響hENT1表達中起重要作用。Gusella等〔4〕發現hENT1GC基因型患者對吉西他濱血清清除率明顯低于GG基因型患者。本實驗結果提示GG基因型患者對GP方案化療更敏感。其機制可能是hENT1(-706)GG基因型改變了hENT1基因啟動子的轉錄活性，降低了hENT1的表達，從而影響了吉西他濱進入腫瘤細胞內的濃度。推測：hENT1(-706)位點SNP是一個潛在的獨立的化療療效預測因子。本研究表明，hENT1(-706)位點SNP可能與接受GP方案化療晚期NSCLC患者的敏感性相關，攜帶GC或CC基因型患者可能提示預后不良。該結果與Myers等〔9〕的研究中提及野生型和變異性單倍體型中hENT1(-706)是影響hENT1表達中最關鍵的SNP位點相一致。同時，需要指出的是：本實驗結果和Gusella等〔5〕研究相反，Gusella等〔5〕發現hENT1(-706)GG型患者的吉西他濱血漿清除率明顯高于hENT1(-706)GC型患者。這可能是因為不同種族人群對同一種化療藥物的特異性不同。本實驗存在一定不足之處：hENT1(-706)位點SNP是否會影響hENT1表達僅在理論上及以前相關研究結果進行推測，因此，在后續研究中應該進一步進行基因及蛋白表達水平的測定，并對結果進行關聯性分析，進一步明確相關耐藥機制。