肝激酶B1基因表達與非小細胞肺癌預后的相關性

金藝鳳 田 靜 王 瑩 焦南林 汪向海 邢 敏

(皖南醫學院附屬弋磯山醫院呼吸與危重癥科，安徽 蕪湖 241001)

肝激酶(LK)B1作為抑癌基因，也被稱為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶11，定位于19p13.3。LKB1缺失可破壞上皮細胞極性，促進腫瘤進展、侵襲和轉移。研究顯示乳腺癌患者低LKB1蛋白表達水平與較差的總生存期(OS)相關〔1〕；人類表皮生長因子受體(HER)2陽性乳腺癌患者低LKB1蛋白表達水平是OS的潛在預測因子〔2〕。研究表明非小細胞肺癌(NSCLC)患者LKB1蛋白表達缺失的患者預后較差，且LKB1低表達水平與臨床病理特征相關〔3〕。本研究探討LKB1在NSCLC患者中的表達情況及與臨床病理特征、預后的相關性。

1 材料與方法

1.1材料 總RNA抽提試劑Trizol購自Invitrogen公司，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒、SYBR Green染料均購自Takara 公司。LKB1抗體為兔抗人的多克隆抗體購自Proteintech公司,內參GAPDH抗體購自Biosharp公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自Jackson Immuno公司。石蠟包埋組織提取試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2病理標本 選擇2014年2月至2016年8月在皖南醫學院弋磯山醫院胸外科行肺癌切除術的患者23例，經病理確診為NSCLC(鱗癌10例、腺癌13例)，同時選擇距癌腫邊緣5 cm以上的正常肺組織，經病理證實無轉移。23例NSCLC患者進行術后無進展生存期(PFS)隨訪，隨訪截止至2016年12月28日。至截止日共18例肺癌組織標本資料完整、有隨訪結果。NSCLC患者根據第8版國際肺癌TNM分期標準修訂稿〔4〕進行分期，術前均未接受過放化療及免疫治療。根據23例NSCLC患者LKB1基因蛋白、mRNA表達的中位水平(0.534、0.227 3)分成兩組；蛋白低表達組12例，高表達組11例；mRNA低表達組13例，高表達組10例。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR) 細胞總RNA按Trizol試劑盒說明書提取并定量。取1 μg RNA逆轉錄合成cDNA。在RT-PCR儀器上進行擴增，以β-actin為內參。LKB1反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共40個循環，LKB1基因上游引物為5′-CATGACTGTGGTGCCGTACT-3′，下游引物為5′-GTGACTGGCCTCCTCTTCTG-3′；β-actin的上游引物為5′-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3′，下游引物為5′-TCATGAGGTAGTCAGTCAGG-3′，基因的表達量用2-ΔΔCt表示。

1.4Western印跡實驗 提取石蠟包埋組織中的蛋白質，把含30 μg蛋白質樣品液與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)電泳樣品緩沖液混合后，在沸水中煮沸5 min變性后，經10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳后電轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。轉好的PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中4℃孵育過夜，加入封閉液稀釋的LKB1一抗(1∶1 000)，以GAPDH(1∶1 000)為內參，室溫孵育2 h，三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBST)洗膜3次，每次10 min；再加入封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST 洗膜3次，每次10 min，增強型化學發生顯影。Tanon GIS 1D4.2圖像分析軟件分析。用軟件ImageJ 1.37v對目標條帶的光密度值進行分析處理并記錄。實驗重復3次。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0軟件行單因素方差

分析、LSD-t檢驗、Kaplan-Meier法分析。

2 結 果

2.1LKB1基因蛋白及mRNA表達水平 肺癌組織LKB1基因蛋白表達(0.600±0.182)和mRNA表達(0.322±0.215)顯著低于癌旁正常組織LKB1基因蛋白表達(1.114±0.951)和mRNA表達(1.086±0.446)(P<0.05)。見圖1。

1～6為6例NSCLC患者圖1 各組LKB1基因蛋白表達

2.2LKB1基因蛋白、mRNA表達水平與臨床病理關系 LKB1蛋白、mRNA表達年齡、臨床分期、腫瘤大小患者中差異無統計學意義(P>0.05)；在不同分化程度患者中存在統計學差異(P<0.05)。見表1。

2.3LKB1基因蛋白、mRNA表達水平與NSCLC患者PFS的關系 LKB1基因蛋白低表達組中位PFS〔9.07(95%CI:5.80～12.34)個月〕明顯短于高表達組〔15.36(95%CI:12.52～18.20)個月〕(P=0.006)。LKB1基因mRNA低表達組根據LKB1基因mRNA表達的中位水平(0.2273)分組中位PFS〔8.20(95%CI:6.29～10.11)個月〕明顯短于高表達組〔16.57(95%CI:11.20～21.94)個月〕(P=0.000)，見圖2、3。

表1 LKB1基因蛋白、mRNA表達與臨床病理關系

圖2 LKB1基因蛋白表達水平與PFS的關系

圖3 LKB1基因mRNA表達水平與PFS的關系

3 討 論

LKB1幾乎在所有組織中都有表達，參與多種細胞過程，包括細胞結構控制、細胞周期調節、細胞凋亡和細胞代謝〔5〕。作為多功能蛋白，LKB1基因是腺苷磷酸激活蛋白激酶(AMPK)通路的主要上游激酶，也是細胞代謝中維持能量平衡的必需元素。LKB1通過激活一組與AMPK相關的激酶來發揮生長抑制作用，通過LKB1激活AMPK相關的激酶在維持細胞極性、抑制癌細胞的異常生長起著至關重要的作用〔6〕。研究表明LKB1作為抑癌基因，通過激活AMPK通路或AMPK相關的激酶，調節細胞周期、細胞凋亡、細胞極性和新陳代謝〔7〕。

LKB1基因在NSCLC常表現為表達缺失或失活突變，且LKB1表達缺失與肺癌發展、腫瘤分化、侵襲與轉移相關〔8〕。李作生等〔9〕研究顯示LKB1基因蛋白的陽性表達率在高分化組、無淋巴結轉移組明顯高于中-低分化組、有淋巴結轉移組，認為LKB1低表達可能影響肺癌的預后。李洋等〔10〕檢測了74例肺癌組織的LKB1、人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)表達水平，發現LKB1表達缺失與肺癌侵襲、臨床分期相關，而與性別、年齡、病理類型無關，認為檢測其蛋白表達可作為NSCLC預后的判斷依據。Xiao等〔11〕對14篇文獻共1 915例實體瘤患者進行Meta分析，結果顯示實體瘤患者低LKB1表達水平與預后較差相關，可作為臨床病理預后的潛在預測因子。但也有研究〔12〕顯示LKB1在細胞內位置不同臨床意義也不同，乳腺癌患者細胞質LKB1高表達水平與OS和DFS顯著下降相關，是預后較差的獨立預后因子；而細胞核LKB1高表達水平與OS和DFS顯著增加相關。

本研究說明LKB1基因的表達異常在肺腺癌和鱗癌中均存在。LKB1基因的表達降低可能導致對腫瘤的抑制作用減弱，進而使腫瘤的惡性程度增加。但本研究中LKB1基因的表達高低與年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤大小無關，可能與樣本數較少有關，在今后研究中將加大樣本量進一步研究。但由于隨訪時間較短，對OS無法作出評估，還有待進一步研究。

綜上，LKB1基因表達水平與NSCLC的組織分化程度相關，且LKB1低表達可能提示預后不良。