硫化氫通過調控Bcl-2/Caspase-3的表達減輕糖尿病大鼠心肌細胞凋亡和纖維化

劉茂軍 梁 彪 李子寧 江振濤 吳志雄 褚 春 楊 軍

(南華大學附屬第一醫院老年醫學科，湖南 衡陽 421001)

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病眾多慢性并發癥中的一類獨立于瓣膜性心臟病、冠心病、先天性心臟病、高血壓心臟病等疾病之外的特異性心肌病變，是糖尿病的一種嚴重的心血管并發癥〔1〕。很多證據顯示其發病機制與氧化應激、細胞凋亡、內質網應激、自噬作用有關〔2〕，但具體發病機制尚未完全明確。研究表明，高血糖是DCM發生發展的核心，它觸發了一系列相關下游信號引起心肌細胞凋亡、心室擴大和心臟功能障礙〔3〕，而心肌纖維化是DCM的一種重要病理改變。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡方式，研究顯示其在DCM的發生發展過程中起著重要作用〔4〕。而細胞凋亡的過程受一系列基因和蛋白，包括Caspase-3和Bcl-2等的調控。硫化氫(H2S)作為一種新型氣體信號分子，它可以通過舒張血管、抗細胞凋亡、抗氧化應激、抗炎癥反應等機制在心血管系統中發揮一定的心肌保護作用〔5〕。H2S已發現可以改善糖尿病心肌纖維化的發生發展過程，但有關機制目前所知尚少。本實驗觀察H2S對糖尿病大鼠心肌纖維化及細胞凋亡和凋亡相關調控蛋白Bcl-2/Caspase-3的表達的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 成年清潔雄性SD大鼠50只，體重(300±20)g，購自長沙東創動物中心，所有大鼠在(23±1)℃恒溫的清潔環境中分籠飼養，人工照明，白天夜黑各12 h，所有大鼠可自由獲得食物和水。

1.2主要實驗試劑 抗 β-actin 抗體和抗兔二抗采購于美國Proteintech公司；抗 Bcl-2 抗體和抗酶切Caspase-3 抗體購于美國Cell Signaling公司；兔源Ⅰ型膠原蛋白和兔源Ⅲ型膠原蛋白購于中國博士德公司；BCA試劑盒和細胞裂解液采購于中國碧云天生物公司。硫氫化鈉(NaHS)試劑購買于美國Sigma公司。

1.3實驗動物分組和糖尿病大鼠模型的建立 首先，適應性喂養SD大鼠1 w,然后隨機分為5組，每組10只：正常對照組(Control組)、糖尿病組(模型組)、低濃度保護組 (c1組)、高濃度保護組 (c2組)、H2S對照組(H2S組)。模型組、c1組和c2組大鼠按照鼠的體重(40 mg/kg)腹腔注射STZ；注射后24 h之內給予5%葡萄糖水供其飲用預防大鼠發生低血糖休克；注射后72 h，通過尾靜脈采血的方法測量血糖，如果血糖大于16.7 mmol/L證明成功建立糖尿病大鼠模型。成功造模后，對照組每天腹腔注射生理鹽水；c1組每天按體重注射相應的NaHS溶液(30 μmol/kg)，c2組與H2S組每天按照體重注射相應的NaHS溶液(100 μmol/kg)。實驗共持續8 w。

1.4Masson 染色觀察大鼠心臟組織纖維化程度 取甲醛固定的心臟組織；石蠟包埋，切片成5 μm厚，切片后常規脫蠟至水。放入Bouin固定液，37℃溫箱內作用2 h，然后用流水沖洗至黃色消失，Weiger鐵蘇木素染5～10 min，流水稍洗，1%鹽酸酒精分化，流水沖洗數分鐘后麗春紅酸性品紅液染5～10 min，1%磷鉬酸水溶液處理5 min，苯胺藍液復染5 min，1%冰醋酸處理1 min，無水酒精脫水3次，每次5～10 s，二甲苯透明3次，最后用中性樹膠封固，顯微鏡下觀察。

1.5免疫組化檢測Ⅰ型及Ⅲ型膠原纖維 取甲醛固定的大鼠左心室心肌組織，石蠟包埋，切片成5 μm厚，切片后脫蠟至水，水中煮沸；取出切片后用蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗。5%～10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min，去除血清；滴加1∶50比例稀釋的一抗工作液，PBS沖洗3次，每次5 min。孵育二抗，37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min。顯色劑進行顯色，然后蘇木精復染，中性膠封片，顯微鏡下觀察，使用Image Pro Plu軟件計算棕色面積比。

1.6TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡 將石蠟切片用二甲苯漂洗2次，然后用梯度乙醇漂洗。PBS沖洗后，加入蛋白酶K溶液，15 min后用雙蒸餾水洗4次，放入封閉液中封閉；PBS沖洗，加入TUNEL反應液，避光下37℃孵育60 min；PBS沖洗，加入轉化劑過氧化物酶(POD)，37℃孵育30 min；PBS沖洗，加入二氨基聯苯胺(DAB)工作液；PBS沖洗，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.7Western印跡法檢測心肌組織Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達 提取5組大鼠新鮮左心室心肌組織的蛋白，采用BCA法定量。電泳后用濕轉法將蛋白質轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用洗膜緩沖液(TBST)配制的5%胎牛血清(BSA)室溫封閉2 h后Bcl-2、Caspase-3及β-actin一抗(稀釋度均為1∶1 000)37℃孵育1 h后4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，每次10 min；用辣根過氧化物(HRP)標記的二抗(稀釋度1∶8 000)37℃孵育1 h；經洗滌、顯影、灰度掃描后，以β-actin為內參，目的條帶與內參條帶的灰度比值代表蛋白表達水平。

1.8統計學方法 采用SPSS18.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1心臟組織Masson染色分析 糖尿病大鼠心臟組織中心肌膠原纖維的沉積較Control組明顯增加，而c1組、c2組使用H2S干預的糖尿病大鼠心肌組織中心膠原纖維的沉積面積比模型組大鼠明顯減少。H2S組和Control組之間無明顯差異。見圖1。

2.2各組心肌Ⅰ型膠原纖維和Ⅲ型膠原纖維比較 與Control組比較，模型組心肌中Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積面積明顯上升，并且膠原纖維排列紊亂，而c1組和c2組心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維沉積面積較模型組有下降趨勢，且排列較模型組心肌組織規則，H2S組與Control組無明顯差異，見圖2，表1。

2.3各組心肌TUNEL染色結果 與Control組相比，糖尿病大鼠心肌中凋亡細胞的數量明顯增加，c1組和c2組心臟中凋亡細胞的數量較模型組明顯減少，H2S組與Control組無明顯差異。見圖3。

圖1 各組心肌組織形態學(Masson染色，×200)

圖2 各組心肌中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達的免疫組化檢測(DAB，×100)

表1 各組心肌中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達、心肌組織中Bcl-2、Caspase-3蛋白表達比較

與Control組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.4各組心肌組織中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達水平比較 與Control組比較，模型組心肌組織中Bcl-2蛋白表達明顯下降(P<0.01)，心肌組織中Caspase-3蛋白表達明顯上調(P<0.01)，而H2S組Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平無明顯差異(P>0.05)；與模型組比較，c1組和c2組心肌組織中Bcl-2蛋白表達水平明顯上調(P<0.01)；c1組和c2組心肌組織中Caspase-3蛋白表達水平明顯下降(P<0.05，P<0.01)。見表1，圖4。

圖3 各組心肌細胞TUNEL染色結果(×400)

1～5：Control組、模型組、c1組、c2組、H2S組圖4 各組心肌組織中Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達

3 討 論

DCM病理結構改變主要表現為心肌細胞肥大、凋亡、壞死、心肌間質纖維化和微血管病變等〔6，7〕。心肌纖維化在DCM的發展過程中扮演著極其重要的角色，本研究顯示糖尿病大鼠出現了心肌間質纖維化。

隨著對糖尿病心肌纖維化機制研究的不斷深入，發現細胞凋亡在其中起著關鍵作用〔8〕。研究表明，在DCM中，各種因素可導致心肌細胞內環境的紊亂，隨著疾病的進展，細胞凋亡的程度增加逐漸超過了細胞增殖的速度，引起心肌凋亡范圍擴大，凋亡的心肌細胞不能再生，逐漸被膠原纖維等替代，形成心肌纖維化〔9,10〕。當機體長期處于高糖、氧化應激、缺血等促凋亡因素作用下，將導致細胞線粒體外膜電位的改變及通透性的增加，從而引起凋亡因子從線粒體內釋放至胞質，引發Caspases級聯通路逐一被激活，引起Caspase-3、Caspase-9等細胞凋亡因子的產生，誘導凋亡的發生。Caspase-3的激活是細胞凋亡信號通路中的關鍵環節，它作為細胞凋亡的效應子能被上游的始動子激活，被激活的Caspase-3作用于下游特定的信號分子，使細胞產生一系列的生物形態學改變，最終可誘導細胞凋亡〔11,12〕。Bcl-2是第一個被證實可以降低細胞凋亡的蛋白，它通過調節線粒體膜上通透性轉換孔的啟閉維持細胞膜的通透性，干擾細胞色素C 的釋放而阻斷上游Caspase蛋白酶的激活，從而抑制細胞凋亡〔13〕。本研究提示長期的高糖刺激可以誘導心肌細胞凋亡的發生，糖尿病大鼠心肌組織中促凋亡蛋白Caspase-3的表達明顯上調，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達明顯下降，提示Caspase-3和Bcl-2在糖尿病心肌纖維化的發生發展過程中可能起著重要作用。

H2S存在于哺乳動物組織和細胞中，是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)后的第三種具有廣泛生理功能的新型內源性氣體信號分子，已被證實在體內具有廣泛的生物學效應，其在心血管系統具有抗細胞凋亡、抗氧化應激、抗炎癥反應、抗纖維化等多種生物學效應。本研究結果提示H2S通過抑制Caspase-3上調和促進Bcl-2表達從而減輕細胞凋亡并改善糖尿病大鼠心肌纖維化。