黃芩素聯合U0126調控人膀胱癌T24細胞凋亡的分子機制

伍連春 陳杰翔 喻小蘭 唐小平 王曉燕 張宇驕 夏紀毅，5

(內江市隆昌縣中醫醫院泌尿外科，四川 內江 642150)

膀胱癌的發生發展與癌細胞的失控增殖、惡性轉移和凋亡息息相關〔1〕。膀胱癌的治療策略之一是促進癌細胞凋亡。細胞增殖和凋亡平衡失控是導致癌變的重要原因〔2〕。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)相關X蛋白(Bax)可促進細胞凋亡，而Bcl-2抑制細胞凋亡，二者相互拮抗，Bcl-2/Bax比值與細胞凋亡密切相關〔3〕。促分裂原激活蛋白激酶(MAPK)參與細胞增殖、分化及癌變，主要包括細胞外調節蛋白激酶(ERK)1/2和P38等信號蛋白，通過調控多種癌基因，促進細胞過度增殖、分化和凋亡，在乳腺癌、結腸癌和肺癌等惡性癌癥中發揮作用。U0126是MAPK抑制劑，可抑制癌細胞增殖，促進凋亡〔4〕。中藥黃芩素在腫瘤中可發揮抑癌作用〔5〕，但黃芩素聯合U0126在膀胱癌中的作用和分子機制還有待進一步研究。

1 材料與方法

1.1材料 人膀胱癌T24細胞株從西南醫科大學附屬醫院醫學實驗中心獲贈，細胞用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素(美國invitrogen公司)的改良杜氏伊格爾(DMEM)培養液(美國hyclone公司)，于37℃、5%CO2細胞孵育箱(型號：HERAcell 240i，美國Thermo Scientific Forma公司)內常規培養。黃芩素(四川成都曼斯特科技公司，純度≥ 98%，批號A0779)；U0126(碧云天生物科技公司，批號S1901)，內參3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)(碧云天生物科技公司，批號AG019)，細胞增殖-毒性檢測(CCK8)試劑盒(南京凱基生物有限公司，批號C0037)，ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38引物由上海生工合成，對應的抗體均購于Cell signal technology公司(ERK1/2批號4695，p-ERK1/2批號9101，P38批號8690，磷酸化(p)-P38批號4511，Bax 批號14796，Bcl-2批號15071)。碘化丙啶(PI)染色液(批號550825，美國BD Biosciences公司)。Annexin V/PI試劑盒(批號556547，美國BD Biosciences公司)。反轉錄試劑盒(型號：K1622，美國Thermo Fermentas公司)，流式細胞檢測儀(型號：BD FACSAria Ⅱ，美國BD Biosciences公司)。全波長酶標儀(型號：Multiskan Spectrum，美國Thermo Electron公司)。

1.2方法

1.2.1CCK8檢測細胞增殖 制備T24細胞懸液，計數細胞；將2×105個細胞接種至96孔板中，每孔100 μl，隨機分為對照組、黃芩素組(加入20 μmol/L黃芩素培養24 h)、U0126組、(加入20 μmol/L U0126培養24 h)、黃芩素聯合U0126組(加入20 μmol/L黃芩素和20 μmol/L U0126共同培養24 h)，每組設置3個復孔，培養24、48、72 h，每個時間點加入10 μl CCK8，混勻；培養4 h，在450 nm處檢測吸光度，計算各組細胞增殖率。實驗重復3次。

1.2.2流式細胞術檢測細胞周期 膀胱癌細胞株T24接種于12孔板，按各分組處理后，收集細胞，室溫磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入1 ml 70%預冷乙醇固定過夜，第2天離心去除乙醇，PBS重懸，加入RNase至終濃度為100 mg/L，37℃水浴30 min，加入PI染色液至終濃度為50 mg/L，4℃避光染色30 min，用激發波長為488 nm的紅色熒光檢測細胞周期。結果采用細胞周期擬合軟件進行分析，實驗重復3次。

1.2.3流式細胞術檢測腫瘤細胞凋亡 各組細胞用Annexin V/PI試劑盒染色，流式細胞儀檢測早期凋亡和晚期凋亡。實驗操作按照試劑盒說明書嚴格執行。收集懸浮細胞，PBS漂洗2次，加入400 μl 1×結合緩沖液(Binding Buffer)重懸細胞，接著加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，室溫避光孵育15 min加入10 μl PI染色液，混勻，避光孵育5 min，流式細胞儀檢測早期凋亡和晚期凋亡。檢測結果采用CellQuest軟件進行分析。實驗重復三次。

1.2.4Real Time PCR檢測細胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平 將各組細胞棄掉培養基，PBS漂洗2遍，Trizol提取總RNA，并以此為模板，Oligo(dT)為引物，采用反轉錄試劑盒K1622反轉錄成cDNA第一鏈，采用Real Time PCR檢測凋亡相關基因的表達水平。引物序列：ERK1/2：前向：AATCACACGGTAGACACTGAAATGCC，反向：CATCATCCCATCTAAAATGTCCCCTG；Bax：前向：CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG，反向：CCAGCCCATGATGGTTCTGAT；Bcl-2：前向：GGTGGGGTCATGTGTGTGG，反向：CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC；P38：前向：CCCGAGCGTTACCAGAACC，反向：TCGCATGAATGATGGACTGAAAT；GAPDH：前向：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向：TGGTGAAGACGCCAGTGGA。

1.2.5Western印跡檢測細胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38蛋白表達和對ERK1/2、P38磷酸化的影響 將各組細胞棄掉培養基，PBS洗2次，加入含5%蛋白酶抑制劑的強裂解液RIPA，冰上裂解20 min，15 000 r/min離心后取上清液，超聲破碎后，收集細胞總蛋白，-20℃保存備用。取10 μg蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，轉膜到0.2 μmol/L聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉的1×Tris-HCl緩沖鹽吐溫溶液(TBST)封閉1 h。ERK1/2、Bax、Bcl-2、P38、p-ERK1/2、p-P38和GAPDH(稀釋比例分別為1∶1 000，1∶800，1∶500，1∶1 000，1∶1 000，1∶1 000，1∶2 000)一抗4℃孵育過夜。1×TBST漂洗2次，10 min/次，加入1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗IgG(H+L)，室溫孵育1 h，1×TBST漂洗2次，5 min/次，凝膠成像儀成像后進行灰度分析，計算相關蛋白的表達水平。試驗重復3次。

1.3統計學分析 采用SPSS19.0軟件，組間比較采用t檢驗，多個樣本之間的兩兩比較采用單因素方差分析。

2 結 果

2.1黃芩素聯合U0126對人膀胱癌T24細胞增殖的影響 單獨應用黃芩素、U0126或聯合應用黃芩素和U0126可顯著抑制細胞增殖，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，且具有時間依賴性，而黃芩素聯合U0126作用對膀胱癌細胞的抑制作用更加明顯(P<0.01)，見表1。

表1 黃芩素聯合U0126對人膀胱癌T24細胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

2.2流式細胞術檢測黃芩素聯合U0126對T24細胞周期的影響 單獨應用黃芩素、U0126或聯合應用黃芩素和U0126 作用24 h，G0～G1期細胞含量增多，S期細胞下降，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，而黃芩素聯合U0126作用對細胞周期的影響更加顯著(P<0.01)，說明二者聯合使用具有協同效應，見表2。

表2 黃芩素聯合U0126對人膀胱癌T24細胞周期的影響

2.3流式細胞術檢測黃芩素聯合U0126對T24細胞凋亡的影響 單獨應用黃芩素、U0126或聯合應用黃芩素和U0126 作用T24細胞24 h，早期凋亡率和晚期凋亡率增多，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，而黃芩素聯合U0126作用對T24細胞早期凋亡率和晚期凋亡率的誘導更加顯著(P<0.01)，說明二者聯合使用具有協同誘導腫瘤細胞凋亡的效應，見表3。

表3 黃芩素聯合U0126對人膀胱癌T24細胞凋亡的影響

2.4Real Time PCR檢測黃芩素聯合U0126對T24細胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA水平的影響 單獨應用黃芩素、U0126或聯合應用黃芩素和U0126 作用T24細胞24 h，Bax mRNA表達增加，Bcl-2 mRNA表達減少，ERK1/2和P38 mRNA水平顯著降低，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)，而黃芩素聯合U0126作用對T24細胞ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA的影響更加顯著(P<0.01)，見表4。

2.5Western印跡檢測黃芩素聯合U0126對T24細胞Bax、Bcl-2蛋白及P38 ERK1/2磷酸化的影響 單獨應用黃芩素、U0126或聯合應用黃芩素和U0126 作用T24細胞24 h，Bax蛋白表達增加，Bcl-2蛋白表達減少，而ERK1/2和P38磷酸化水平顯著降低，與對照組比較差異具有統計學意義(P<0.05)；而黃芩素聯合U0126作用對Bax、Bcl-2蛋白和P38、ERK1/2磷酸化的影響更加顯著(P<0.01)，見圖1，表5。

表4 各組ERK1/2、Bax、Bcl-2和P38 mRNA相對表達量分析

1.對照組；2.黃芩素組；3.U0126組；4.黃芩素聯合U0126組圖1 黃芩素聯合U0126對T24細胞Bax、Bcl-2蛋白及P38、ERK1/2磷酸化的影響

表5 Bax、Bcl-2蛋白相對表達量和p-ERK1/2、p-P38 磷酸化水平分析

3 討 論

膀胱癌是泌尿系統最常見的癌癥，膀胱上皮性腫瘤占95%～98%，其中移行細胞癌約占90%，少數鱗狀上皮癌和腺癌等非上皮性腫瘤占2%～5%〔6〕。膀胱癌的發生發展與細胞增殖和凋亡息息相關，多種生長因子、癌基因及它們之間的相互作用在膀胱癌的增殖和凋亡中發揮著重要作用〔7〕。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中最重要的兩個成員，主要分布于細胞質中的線粒體、內質網和核膜上，Bax可拮抗Bcl-2的功能，促進細胞凋亡；Bcl-2對多種因素介導的凋亡產生抗性，抑制細胞凋亡〔8〕。本研究結果表明，單獨使用黃芩素或U0126作用T24細胞，可促進Bax表達升高，Bcl-2表達降低，而黃芩素和U0126聯合使用使Bax表達升高及Bcl-2表達降低的作用更加顯著，進而促進腫瘤細胞的早期凋亡和晚期凋亡。

MAPK是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，其主要成員ERK激活或磷酸化與細胞增殖有關〔9〕。ERK/MAPK信號通路可被生長因子、血清、GPCR的配體和轉錄因子等激活，將細胞外刺激傳遞至細胞核，參與細胞正常的生長、發育和分化〔10〕。同時，ERK信號通路還可參與細胞的惡性轉化和癌癥的發生發展，近年來的研究發現，ERK1/2在膀胱癌中被顯著激活，促進細胞增殖〔11〕。本研究結果表明，單獨使用黃芩素或U0126作用T24細胞，可抑制ERK1/2 mRNA和蛋白的表達，ERK1/2磷酸化顯著降低；聯合使用黃芩素和U0126作用于細胞，對ERK1/2 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加顯著，進而抑制腫瘤細胞的增殖能力，絕大多數細胞停留在G0～G1期，細胞凋亡能力顯著增強。

在膀胱癌患者中，P38的表達和磷酸化水平顯著增加，因此，P38信號通路在膀胱癌的發生發展中起著重要作用〔12〕。本研究結果表明，單獨使用黃芩素或U0126作用T24細胞，可抑制P38 mRNA和蛋白的表達，P38磷酸化顯著降低，聯合使用黃芩素和U0126作用于細胞，對P38 mRNA和蛋白的抑制作用及抑制ERK1/2磷酸化作用更加顯著，腫瘤細胞增殖受到抑制，凋亡顯著增強。因此，聯合使用黃芩素和U0126可通過調控ERK1/2和P38信號通路作用于膀胱癌。

綜上所述，黃芩素聯合U0126具有協同效應，可通過調控ERK1/2和P38信號通路抑制人膀胱癌細胞增殖，改變細胞周期，進而誘導腫瘤細胞凋亡，為膀胱癌治療和機制研究提供參考依據。