苯乙基異硫氰酸酯對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡、周期和侵襲轉移能力的影響及機制

甘輝云 杜敬東 歐陽虹 程 杰

(三峽大學附屬仁和醫院耳鼻咽喉科，湖北 宜昌 443001)

異硫氰酸酯類化合物(ITCs)可由十字花科植物如花椰菜、甘南、水芹等提取得到，是十字花科植物發揮抗腫瘤作用的主要成分。近年來ITCs因其良好的抗腫瘤作用而受到廣泛關注，苯乙基(PE)ITC是其中研究最為廣泛的一種〔1〕。多項體內外研究結果顯示，PEITC在包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌及血液系統腫瘤等多種腫瘤中可發揮明顯的抗癌活性。PEITC的抗腫瘤活性包括抑制Ⅰ相代謝酶的活性及激活Ⅱ相代謝酶、抑制腫瘤細胞增殖，誘發腫瘤細胞凋亡和細胞周期阻滯、誘導細胞內活性氧自由基(ROS)水平升高和促進氧化應激過程、誘導線粒體凋亡途徑、抑制新生血管生成和腫瘤侵襲轉移等〔2,3〕。PEITC具有相當可觀的抗腫瘤潛力，然而目前對其作用及機制研究還不夠透徹〔4～6〕。迄今為止，國內外尚無研究報道PEITC在喉癌中的作用。本研究觀察PEITC對Hep-2細胞增殖、凋亡、周期及侵襲能力的影響，分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 人喉癌細胞株 Hep-2，人支氣管上皮細胞株 16HBE購自四川大學醫學實驗室，儲存于液氮中。主要試劑：PEITC 美國(Sigma 公司)；培養基 RPMI1640、胰蛋白酶(Hyclone 公司)；胎牛血清(美國 Gibco 公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，杭州吉諾生物醫藥技術公司)；二甲基亞砜(DMSO，Invitrogen公司)；細胞計數試劑盒(CCK8，日本dojindo公司)；AnnexinV-PI細胞凋亡檢測試劑盒，PI細胞周期檢測試劑盒(杭州聯科生物技術有限公司)；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒(瑞士Roche 公司)；人工重組基底膜Matrigel膠(美國BD公司)；Tanswell Chamber(美國Costar公司)；鏈霉素青霉素雙抗液、細胞總蛋白提取試劑盒(武漢谷歌生物)；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國 Millipore 公司)。

1.2實驗分組 選擇對數生長期的喉癌Hep-2細胞和人支氣管上皮16HBE細胞，按完全隨機的原則分為6組，空白組：常規培養；DMSO(0.0 μmol/L)組：于培養基中加入與藥物處理組等體積的 DMSO；藥物組：分別給予不同濃度的PEITC(2.5、5.0、7.5、10.0 μmol/L)處理喉癌Hep-2細胞，PEITC (5.0、10.0、15.0、20.0 μmol/L)處理人支氣管上皮16HBE細胞。

1.3CCK8檢測細胞活性 0.25%胰酶消化，計數并接種細胞于96孔板，每孔細胞數量為2 000～5 000個，37℃ 5%CO2條件下培養12～24 h；每組設6個復孔，另設4個孔作為空白對照組(加入與處理組等量的培養液和CCK8檢測液，無細胞)。吸去原培養液，加入含藥物培養液至各組對應的PEITC終濃度。每孔中加入CCK8檢測液10 μl，注意關掉光源；使用酶標儀檢測各組在450 nm波長的吸光度數值；計算各組細胞的增殖抑制率。

1.4流式細胞儀檢測細胞凋亡率及周期 依據實驗分組方案給予每組DMSO或不同濃度PEITC處理，每組平行設3個復孔。繼續培養24 h后，將原細胞培養液吸出至離心管內，PBS洗滌細胞，加入適量胰酶消化，室溫孵育致使貼壁細胞可被輕輕吹打下來時，加入之前吸至離心管內的對應各組細胞培養液。將混勻的細胞懸液轉移至另一5 ml離心管，經AnnexinV-PI染色后，使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，用300目(孔徑40～50 μm)尼龍網過濾，上機檢測細胞周期。

1.5TUNEL染色 用胰酶消化細胞，加入含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養基中和胰酶，吹打混懸細胞，對細胞懸液進行細胞計數，低倍鏡下分別計數4個方格的細胞總數，公式如下：細胞總數=(4個方格的活細胞總數/4)×104×稀釋倍數，調整細胞濃度為1×104/ml。上述細胞懸液接種于已置入爬片的6孔板中，每孔500 μl；于熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞：綠色熒光的發射波長范圍為515～565 nm。計算結果時，每樣本隨機選取10個高倍鏡下視野，計數TUNEL陽性細胞所占全部細胞的比例，以反映腫瘤細胞的凋亡率。每個實驗重復3次。

1.6Transwell侵襲實驗 將Matrigel膠放置于4℃過夜使其充分溶解，稀釋至終濃度為200 μg/ml(用預冷后的超純水或PBS)；每孔Transwell上室鋪入50 μl濃度為200 μg/ml的Matrigel凝膠，37℃放置2 h以上或者超凈臺過夜風干；在Transwell上室加入無血清RPMI1640培養基100 μl/孔，室溫下于搖床上100 r/min放置1 h，吸取未結合的液體；將處于對數生長期的各組經不同濃度PEITC處理的細胞，以不含血清的RPMI1640培養液重懸，制作細胞懸液(調整細胞濃度為5×104/L)；將處理好的單細胞懸液用移液器取每孔100 μl，緩緩加入Transwell上室，在下室加入含10%血清的培養液500～600 μl；48 h后棄去孔內培養液，取出小室，PBS沖洗1次，甲醇-丙酮固定液固定10 min；以棉簽輕輕拭去上室面黏附的細胞；結晶紫染色10 min，沖洗3次，用中性樹膠封片；顯微鏡下計數穿膜細胞數，選取上下左右隨機6個視野，以每視野觀察到的細胞平均數代表細胞侵襲能力，每組平行設3～5個濾膜。

1.7Western印跡 在處于對數生長期的細胞中加入對應濃度的PEITC，培養24 h后，棄去培養液，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每次5 min，棄去洗液，晾干；配制蛋白標準品(濃度為25 mg/ml)，分裝避免反復凍融，使用時稀釋至終濃度為5.0 mg/ml；96孔板中，在蛋白標準溶液孔中按0，1，2，4，8，12，16，20 μl順序加入蛋白標準品，PBS補足20 μl；在樣品孔中加入2 μl樣品(依據蛋白濃度酌情調整)，PBS補足20 μl。每樣品設4個復孔。在96孔板中每孔加入200 μl配好的BCA工作液，37℃恒溫箱避光孵育30 min；檢測A570 nm波長下的吸光度值；以標準蛋白質濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線。根據標準曲線計算樣品吸光值，求出樣品稀釋后濃度，樣品實際濃度=樣品稀釋后濃度×稀釋倍數(單位：μg/μl)。應用Odyssey雙色紅外激光成像系統(LI-COR公司，美國)掃描，Odyssey圖像處理軟件半定量分析顯影條帶。

1.8統計學處理 使用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析，方差齊者采用SNK檢驗，方差不齊者進行TamhaneT2檢驗。每組隨時間變化資料均數之間的比較采用重復測量方差分析。

2 結 果

2.1不同濃度PEITC對細胞增殖的影響 隨著PEITC濃度和作用時間的增加，Hep-2細胞的增殖能力顯著下降，下降趨勢具有濃度和時間依賴性，各藥物處理組細胞吸光度數值與0.0 μmol/L組差異顯著(P<0.05)，其中以10.0 μmol/L的PEITC作用效果最為顯著；而5.0 μmol/L和10.0 μmol/L的PEITC處理正常人支氣管上皮16HBE細胞后，相比0.0 μmol/L組而言，細胞吸光度數值變化無顯著差異。由此說明PEITC在能夠有效抑制腫瘤細胞增殖的濃度范圍內，對16HBE細胞的增殖活性影響不大。見表1。

表1 不同濃度PEITC對細胞增殖活性細胞凋亡率的影響

與0.0 μmol/L相比：1)P<0.05，2)P<0.01；表2同

2.2不同濃度PEITC對細胞凋亡的影響 2.5 μmol/L組Hep-2細胞凋亡率與0.0 μmol/L組比較無明顯差異(P>0.05)，5.0 μmol/L組相較0.0 μmol/L組有顯著差異(P<0.05)，而7.5 μmol/L組與10.0 μmol/L組和0.0 μmol/L組相比有顯著差異(P<0.01)，提示PEITC濃度達到5.0 μmol/L即可顯著誘導Hep-2細胞凋亡，PEITC誘導腫瘤細胞凋亡呈劑量依賴性；而在16HBE細胞中，5.0 μmol/L組和10.0 μmol/L組與0.0 μmol/L組相比差異無統計學意義(P>0.05)，說明10.0 μmol/L以內的PEITC并沒有誘導16HBE細胞凋亡發生顯著變化。15.0、20.0 μmol/L組與0.0 μmol/L組相比差異顯著(P<0.05)。見表1。

2.3不同濃度PEITC對細胞周期分布的影響 隨著PEITC的濃度升高，G0/G1期細胞比例減少(P<0.05)，G2/M期細胞比例上升(P<0.05)，S期細胞比例略微上升(P>0.05)，提示PEITC誘導Hep-2細胞發生了G2/M期阻滯。見表2。

2.4不同濃度PEITC對Hep-2細胞凋亡的影響 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μmol/L組細胞平均凋亡率分別為1.32%±2.57%，4.80%±1.77%，8.98%±4.41%，19.50%±1.58%，44.23%±2.31%，說明PEITC以劑量依賴性方式誘導Hep-2細胞凋亡。見圖1。

表2 流式細胞儀檢測不同濃度PEITC對細胞周期分布的影響

2.5不同濃度PEITC對細胞侵襲能力的影響 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μmol/L組細胞平均侵襲數分別為298.25±24.23，275.52±44.21，154.65±14.25，97.73±9.54，52.51±4.38。PEITC可以顯著降低Hep-2細胞侵襲能力，隨著給藥濃度增加，Hep-2細胞侵襲能力顯著下降，與0.0 μmol/L組相比，5.0，7.5和10.0 μmol/L組差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

DAPI：4′,a-二胺基-2-苯基吲哚圖1 TUNEL法檢測不同濃度PEITC對Hep-2細胞凋亡的影響(×200)

圖2 Transwell侵襲實驗檢測不同濃度PEITC對Hep-2細胞侵襲能力的影響(×200)

2.6不同濃度PEITC對Hep-2細胞胞內磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/Akt信號通路及其下游蛋白表達水平的影響 PEITC處理前，Hep-2細胞中PI3K/Akt通路蛋白PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3Kp110β、p-Akt、總-Akt、磷酸化3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(p-PDK)1及其下游關鍵蛋白糖原合成酶激酶(GSK)3-β、p-核轉錄因子(NF)-κBp65、總-NF-κBp65、Bcl-2、Bax和Bcl-xl表達水平均較高，而在PEITC處理后，PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3Kp110β、p-Akt、p-PDK1、GSK3-β、p-NF-κBp65、Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達水平明顯下調，呈濃度依賴性，促凋亡蛋白Bax表達上調，而總Akt和NF-κBp65水平基本不變。不同濃度藥物處理組細胞與0.0 μmol/L組相比PI3K/Akt信號通路關鍵蛋白表達水平的差異均具有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 不同濃度PEITC對Hep-2細胞PI3K/Akt信號通路蛋白及下游蛋白表達水平的影響

3 討 論

流行病學調查研究顯示，飲食中十字花科植物的攝入水平與多種人類腫瘤發病率的降低呈顯著負相關〔7〕。十字花科植物如西蘭花、甘南、水芹等，因其獨特的天然抗癌活性，受到了廣泛關注。ITCs是大量存在于十字花科植物中的硫苷酶解產物，是十字花科植物中關鍵的抗腫瘤活性成分，而PEITC是其中研究最為廣泛的一種〔8〕。PEITC的抗腫瘤作用是多方面的，包括抑制Ⅰ相代謝酶的活性及激活Ⅱ相代謝酶、誘發腫瘤細胞凋亡和周期阻滯、激活氧化應激過程及線粒體凋亡途徑、抑制新生血管生成和腫瘤侵襲轉移等。研究發現PEITC對包括前列腺癌、乳腺癌、肺癌等細胞均具有抗腫瘤作用。本實驗發現PEITC可以有效抑制喉癌細胞的增殖，促進喉癌Hep-2細胞的凋亡，并誘導G2/M期阻滯。同時，PEITC還能夠抑制喉癌Hep-2細胞的體外侵襲能力。而相同濃度的PEITC作用于人支氣管上皮16HBE細胞，并沒有引起細胞增殖和凋亡發生顯著改變。PEITC發揮抗腫瘤作用可能與下調PI3K/Akt通路蛋白PI3KclsssⅢ、PI3Kp110α、PI3K-p110β、p-Akt、p-PDK1及下游關鍵蛋白GSK3-β、p-NF-κBp65、Bcl-2、Bax和Bcl-xl的表達水平相關。

PI3K/Akt信號通路被認為是癌細胞存活的首要通路之一，有“抗凋亡通路”之稱。該信號通路異常激活，可引起細胞過度增殖及代謝紊亂，從而導致多種腫瘤的發生發展〔9,10〕。PI3K通過直接或間接方式被激活，從而催化質膜生成第二信使PIP3，PIP3和Akt結合形成復合物，導致Akt在激酶PDK1和PDK2的作用下被激活。活化的Akt通過磷酸化作用激活或抑制其下游的Bcl-2/Bcl-XL相關死亡促進因子(BAD)、NF-κB、霉帕霉素靶蛋白、GSK3-β、Forkhead蛋白家族和caspase蛋白家族等，進而參與調控細胞增殖、凋亡、分化、侵襲轉移等多種生理過程。目前已證實在肺癌、乳腺癌、結腸癌、白血病等多種惡性腫瘤中，都存在著PI3K/Akt信號通路的異常激活，其活化程度與腫瘤的惡性程度密切相關。近來研究顯示，頭頸部鱗癌的發生發展也與PI3K/Akt信號通路的活化有密切聯系。本文結果說明PEITC誘導喉癌細胞凋亡及抑制細胞增殖，可能與下調PI3K/Akt信號通路及下游蛋白的表達水平有關；這與PEITC胰腺癌和乳腺癌細胞中的研究結果類似〔11～13〕。傳統放化療對腫瘤細胞的殺傷作用缺乏選擇性，殺傷腫瘤細胞的同時，不可避免地損傷正常細胞和組織，引起局部或全身不良反應。PEITC在較低濃度范圍內對喉癌Hep-2細胞有著顯著的抗腫瘤作用，而正常人支氣管上皮16HBE細胞對同等濃度范圍內的PEITC不敏感，這證實作為抗腫瘤藥物，PEITC對非腫瘤細胞是相對安全的。研究證實PEITC僅能誘導人慢性淋巴細胞白血病細胞凋亡，對健康淋巴細胞毒性很低〔14,15〕。PEITC高效無毒的特性使其成為具有潛力的天然抗腫瘤活性藥物。

總之，PEITC能夠有效抑制喉癌Hep-2細胞的增殖能力，促進細胞凋亡，誘導細胞發生G2/M期阻滯及抑制細胞體外侵襲能力，其作用可能與下調PI3K/Akt通路及下游關鍵蛋白的表達水平有關。此外，在能夠有效抑制腫瘤細胞的濃度范圍內，PEITC對正常人支氣管上皮16HBE細胞無顯著影響。本實驗僅從體外研究探討了PEITC抗喉癌作用及其分子機制，但是對于確切的PEITC在喉癌中的作用方式還有待在體實驗去闡明。