電針對腦卒中后抑郁大鼠腦細胞生長因子EGF、BFGE表達的影響

余 濤 陸方琴 嚴嘉寧 趙立峰 韋登明

(寧波大學醫學院病理學教研室，浙江 寧波 315211)

腦卒中后抑郁(PSD)指腦卒中導致的有明顯臨床癥狀的一種繼發性抑郁癥，是腦卒中發生后以情緒低落、興趣減退為主要表現的一種心理障礙。電針治療是一種安全無毒療效顯著的治療手段，前期研究已經確定其對PSD有治療效果〔1〕。但其治療機制尚不完全清楚。有研究證實，普通慢性抑郁癥患者或動物均出現海馬體積減少的現象，海馬體積的減少與海馬神經發生障礙有關。表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細胞生長因子(BFGF)被證實能促進胚胎或成年神經干細胞的分裂增殖〔2〕。但PSD的發病及電針治療機制是否與海馬BFGF和EGF表達變化有關，尚有待研究。本實驗擬分析電針對PSD大鼠海馬神經細胞發生的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 Wistar大鼠40只，購于浙江大學醫學院實驗動物中心，動物合格證號0102016。均為雄性，體重280～320 g，自由飲食。大鼠適應性喂養7 d后，隨機分為正常組、假手術組、模型組和電針治療組，每組10只，采用Open-field法進行行為學檢測。

1.2試劑儀器 G6805電針儀(上海華誼儀器制造廠生產)，曠場及記錄儀(上海移數動物學系統)，兔抗大鼠EGF、BFGF多克隆抗體，生物素化羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G、SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，JD801形態學圖像分析系統(江蘇捷達有限公司)，BM-Ⅶ包埋機(宏業醫用儀器公司)，HM-325石蠟切片機(德國LEICA公司)，CX40生物顯微鏡(日本olympus公司)。

1.3模型制備 腦卒中模型制備和PSD模型制備。腦卒中模型制備參照王蕊等〔3〕推薦的方法對模型組、電針治療組進行造模，將大鼠用10%水合氯醛(3 ml/kg體重)麻醉后，仰臥位固定在手術臺上，常規消毒，頸正中切口，暴露雙側頸總動脈(CCA)并分離出迷走神經。隨即用無創動脈夾夾閉CCA，夾閉10 min再通20 min，再夾閉10 min。青霉素粉劑局部消毒再縫合傷口，放回籠中保溫飼養。假手術組麻醉及手術過程同上，但不夾閉CCA。正常組不做任何處理。模型成功的標志是大鼠即刻出現Horner征。PSD模型制備參照洪燈等〔4〕的方法，對腦卒中模型成功的大鼠予以慢性溫和應激(CUMS)制備PSD模型。具體操作：①夾尾1 min；②禁水17 h；③4℃強迫游泳5 min；④持續光照17 h；⑤水平搖晃5 min；⑥傾斜鼠籠(45°)17 h；⑦濕籠(100 g鋸屑+200 ml水)21 h；⑧行為限制(束縛)2 h；⑨禁食禁水20 h。9種刺激每日隨機采取1種，但同種刺激不連續出現，連續不間斷刺激21 d。

1.4電針治療方法 進行不同時間周期連續治療。電針治療組大鼠術后1 w手術切口已基本愈合。PSD模型制備成功后傷口已痊愈，開始給予電針治療。針刺穴位參考《實驗針灸學》〔5〕：用28號30 mm長毫針，于百會穴(頂骨正中)斜刺1.67 cm，大椎穴(第7頸椎與第1胸椎間背部正中)正刺1.67 cm。連接G6805電針儀，施以連續波，頻率50 Hz，強度以大鼠安靜耐受為度(約2.0 rflA)，每天電針1次，留針20 min，連續治療15 d。

1.5行為學檢測 參照林曉春等〔6，7〕的曠場試驗法：將大鼠單個放入開野箱的中央格，開始記錄其活動。以雙后肢穿越一方格邊界記為一次水平運動，以兩前肢離地且直立記為一次垂直運動，二者反映動物的探究活動，檢測6 min(其中第1分鐘不計，使大鼠適應環境，共計5 min數據)，實驗期間保持環境安靜與黑暗。及時清除每只動物的排泄物，并噴灑酒精去除箱底、邊異味，各組交替測試。每只動物進行1次(1次/6 min)。測定5 min內箱內大鼠水平運動次數和垂直運動次數。曠場試驗的水平活動反映大鼠運動活動性水平；垂直活動的多少則反映其興趣高低。分別在造模前、造模后和治療后測定大鼠行為變化。

1.6腦組織生長因子免疫組織化學染色方法 實驗結束后，灌注固定后取腦，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(0.3 ml/100 g體重)，暴露心臟，先用靜脈套管針經主動脈用100 ml生理鹽水進行沖洗，再灌注由4%多聚甲醛與1%戊二醛組成的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)200 ml，灌注約40 min，灌注完畢后斷頭取大腦組織。將取出的腦組織浸沒于裝有甲醛固定液管中，并置于-80℃冰箱保存24 h。

石蠟包埋切片制作并進行免疫組織化學染色：切片經常規脫臘、脫水、3%過氧化氫(H2O2)在37℃下處理15 min;微波抗原修復后滴加10%正常羊血清在37℃下處理 10 min，勿洗;滴加1∶100稀釋的一抗(抗BFGF、EGF)，在4℃下處理24 h;滴加生物素化羊抗兔IgG二抗(1∶100)在37℃下處理2 h;滴加SABC適量，在37℃下處理1 h;二氨基聯苯胺(DAB)顯色5～10 min;陰性對照實驗用PBS代替一抗，其余步驟相同。每步之間用0.1 mol/L PBS(pH值7.4)洗3次，每次5 min。常規脫水、透明、封片，光學顯微鏡下觀察免疫組化染色結果。結果判斷：顯微鏡下海馬神經細胞胞質呈棕色為陽性細胞，每張切片在400倍顯微鏡下選取4個視野用 RY-2000瑞醫病理圖文分析系統計算其積分光密度〔8〕。

1.7統計學檢測 采用SPSS13.10統計軟件進行單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組BFGF、EGF積分光密度比較 正常組、假手術組腦組織見較多EGF和BFGF免疫陽性細胞;模型組很少，較正常組顯著下降(P<0.05)。電針治療組較模型組EGF和BFGF積分光密度值明顯增高(P<0.05)，見圖1，表1。

圖1 各組腦組織EGF、BFGF免疫陽性細胞比較(×400)

表1 各組BFGF、EGF積分光密度比較

與模型組比較：1)P<0.05；同表2

2.2各組水平、垂直運動次數比較 正常組與假手術組水平、垂直運動次數差異無統計學意義(P>0.05)，模型組較正常組和假手術組明顯減少(P<0.05)，電針治療組較模型組明顯增多(P<0.05)，見表2。

表2 各組水平、垂直運動次數比較次)

3 討 論

PSD相當于中醫學中“郁證”的范疇，屬于因病致郁〔9，10〕，其病因機制復雜，發病機制尚不清楚。有文獻〔11〕報道，腦卒中后第1年的PSD發病率為20%～50%。PSD 不僅影響患者神經及肢體功能的康復，降低生活質量及生活滿意度，同時也增加了腦卒中病死率，給患者親屬帶來精神和經濟上的極大負擔。

目前西藥在PSD的治療中明顯存在副作用嚴重、起效慢、價格昂貴等問題。中藥方面，肖瀟〔12〕以逍遙散加味為基本方治療，在改善患者中醫癥狀、對患者神經功能缺損的改善及提高患者日常生活能力方面效果頗好，且起效快，副作用少；陳德仁〔13〕用丹梔逍遙散加減治療PSD，患者癥狀顯著改善，生活自理能力有所提高。Kim等〔14〕發現電針可改善抑郁狀態，王忠華〔15〕電針治療PSD，發現治療效果優于口服百憂解。針刺作為一種傳統的治療手段正逐漸被接受，其在改善患者臨床癥狀及生活質量方面療效確切，已成為藥物治療抑郁癥的有效補充〔16〕。百會和大椎是2個益智要穴，位于督脈之上。百會位居巔頂，為手足三陽經與督脈及陰肝經之會，為督脈要穴，百脈聚會之處，故可調補中氣，健腦寧神；大椎為“三陽督脈之會”〔17〕。針刺兩穴，可醒腦益智開竅、振奮陽氣，并達陽以生陰之功〔11〕。以往研究表明，電針百會、大椎穴有提高腦卒中大鼠海馬神經突觸素(Syp)表達和增加海馬神經元數量的作用，從而增強海馬突觸可塑性，而海馬神經突觸可塑性提高與促進海馬神經細胞發生有關〔18〕。故本實驗選穴以督脈之百會、大椎為治療穴。

腦卒中發病時，腦組織的缺血缺氧使神經元能量代謝發生障礙，引起谷氨酸大量釋放，導致谷氨酸受體過度活化，產生興奮性毒性，導致神經元變性、死亡〔19〕。BFGF主要定位于海馬CA2神經元〔20〕，可以作為反映創傷愈合的細胞因子；EGF主要定位于嗅球、下丘腦及小腦神經元組織中〔21〕。有研究表明BFGF可以促進有絲分裂，促進微血管的生長及分化，增加局部毛細血管數，促血管生成，在神經損傷中保護神經元細胞，促進神經膠質細胞分裂增殖〔22〕。BFGF不僅能縮小大鼠腦梗死面積，還可以使缺血損傷后的腦血流量顯著增加。在腦缺血損傷的治療中，能使神經再生，從而促進腦缺血后的神經功能恢復〔23〕。EGF對于哺乳動物細胞是強力的有絲分裂因子，可促進中樞神經系統神經元祖細胞、神經元及神經膠質細胞增殖和分化。其還是一個重要的神經營養因子，可通過刺激甲狀腺激素和多功能蛋白聚糖G3片段來促進神經突生長〔24〕。EGF具有與BFGF類似的作用，二者不僅具有有絲分裂原的作用，還可促進細胞分化并決定細胞分化方向，實驗證明BFGF和EGF聯合使用，可誘導骨髓基質細胞化(BMSCs)分化為神經樣細胞〔25〕。而對神經干細胞分化方向上的影響存在明顯差異，BFGF作用下分化的細胞主要表達神經元細胞特異性標志分子，EGF作用后則主要分化為神經膠質細胞〔26〕。本研究行為學結果提示，電針對PSD大鼠的抑郁治療有效。本研究免疫組織化學染色結果表明，電針對PSD大鼠神經元的修復與再生有促進作用。因抑郁癥患者海馬體積縮小，結合本實驗結果認為，針刺改善PSD大鼠神經元的修復與再生的機制可能由于提高了海馬神經生長因子BFGF和EGF的含量，從而對海馬神經元的可塑性進行調節，促進海馬神經細胞發生和神經功能的恢復，這可能是針刺抗抑郁的分子機制之一，電針對調節PSD大鼠海馬神經再生的具體機制有待于進一步研究加以明確。