沉默E盒鋅指結合蛋白1對乳腺癌細胞增殖及凋亡的影響

高學忠 袁惠玲 吳麗華

(東莞市人民醫院乳腺科，廣東 東莞 523000)

乳腺癌發生于乳腺上皮組織，是一種主要發生于女性的惡性腫瘤，乳腺癌的發病率呈逐年上升趨勢，加上乳腺癌具有早期癥狀不明顯、發展速度快等特點〔1，2〕。乳腺癌的發生同基因的異常表達有關，這些異常表達的基因能夠通過影響乳腺癌細胞的多種生物學特性影響腫瘤的發生〔3〕。E盒鋅指結合蛋白(ZEB)1是一種鋅指類蛋白轉錄的調控因子，最初在鼠的肢體、脊髓等組織中發現，其表達異常后可以引起較為嚴重的胚胎畸形〔4，5〕。ZEB1在腫瘤組織中的表達水平普遍較高，并且與腫瘤的惡性程度有關，之前的研究報道顯示，ZEB1沉默具有抑制結腸癌、肝癌等細胞增殖并誘導凋亡的作用，而對于沉默ZEB1在乳腺癌細胞增殖凋亡中的作用尚不明確〔6，7〕。本研究用乳腺癌細胞作為研究對象，通過siRNA下調乳腺癌細胞中ZEB1的表達，探討沉默ZEB1對乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細胞MDA-MB-231購自美國ATCC；慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control由吉滿生物科技(上海)有限公司構建；RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；cDNA合成試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司；ZEB1抗體、激活型Caspase-3(酶切Caspase-3)抗體、細胞周期素(cyclin)E抗體均購自美國CTS；p27抗體、細胞色素(Cytochrome)C抗體均購自美國Abcam；胞質蛋白提取試劑盒、線粒體蛋白提取試劑盒均購自美國Thermo。

1.2細胞分組 MDA-MB-231細胞培養至對數期以后，接種到12孔細胞培養板內，細胞培養液密度為1×105個/ml，細胞匯合度為40%時，進行慢病毒感染。用含有455 μl培養基、100 μg/ml的polybrene、1×108TU/ml的病毒液20 μl均勻混合后，添加到用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后的上述細胞中，感染后10 h進行換液，培養3 d后，觀察熒光表達情況，感染效率高于90%，用于后續實驗。把感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA和LV-siRNA control的細胞分為ZEB1 siRNA組和siRNA control組，把沒有感染的細胞作為Control組。取上述細胞，以熒光定量PCR和Western印跡檢測沉默效果。

1.3熒光定量PCR檢測沉默效果 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞按照每107個細胞加入1 ml的Trizol溶液裂解細胞以后，按照常規方法提取細胞中的總RNA，RNA用無RNase的水溶解后，置于-80℃保存。移液槍吸取2 μl RNA樣品，以紫外分光光度計測定A260/A280的比值在1.8～2.0之間。每組樣品吸取2 μg的RNA，反轉錄合成cDNA，步驟同cDNA合成試劑盒，cDNA保存在-20℃。取各組cDNA，進行熒光定量PCR反應，配制25 μl體系，包含cDNA 1 μl、1 μl的10 μmol/L上下游引物、12.5 μl的2×SYBR Green Supermix。PCR儀程序為：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40個循環。β-actin作為內參，以Step One分析擴增產物的Ct值，計算ZEB1水平。引物如下：β-actin-上游引物5′-GAGGAGGAGGAGAAGGAAT-3′，下游引物5′-AGCCAGTAGTAGCCAACA-3′。ZEB1上游引物5′-GGCAGAGAATGAGGGAGAAG-3′，下游引物5′-CTTCAGACACTTGCTCACTACTC-3′。

1.4Western印跡檢測沉默效果 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞中加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，放在冰上充分裂解約30 min，收集上清，用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒對蛋白定量。將蛋白同十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上樣緩沖液在100℃孵育5 min后，在每個上樣孔中加入20 μg的蛋白樣品。蛋白凝膠用10%分離膠和5%的濃縮膠進行電泳，蛋白樣品在濃縮膠中以70 V電壓進行電泳，以100 V電壓在分離膠中電泳，肉眼觀察染料跑出凝膠之后終止電泳。取出凝膠，進行轉膜。轉膜條件為：100 mA，4℃，此時蛋白從凝膠轉移至NC膜上。取NC膜，進行抗體孵育，NC膜置于含有5%牛血清白蛋白封閉液的平皿中，置于室溫條件下孵育1 h，再將NC膜置于含有1∶800稀釋的抗ZEB1抗體中，在4℃中結合反應12 h，再同辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(1∶3 000稀釋)置于室溫中結合孵育2 h。電化學發光(ECL)法發光以后，曝光。對各蛋白條帶進行灰度值掃描，β-actin為參照，用各組目的條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白水平。

1.5MTT法檢測細胞增殖能力 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞接種到96孔板，分別在培養1 d、2 d、3 d、4 d后各取出一個培養板，進行MTT檢測。MTT方法為：按照每個孔內加入20 μl的MTT，放在37℃的培養箱中孵育結合4 h，把培養板取出后，按照每個孔中加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，在震蕩儀上反應10 min，再放置于酶標儀上，檢測波長490 nm的A值，用不加入細胞的孔調零。

1.6流式細胞術檢測細胞周期 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞以0.25%的胰酶消化后，用PBS洗滌，加入用PBS配制的75%的乙醇，放在4℃條件中孵育過夜。收集細胞，加入RNaseA酶，添加50 μg/ml的PI染液，混合后，放在4℃孵育結合，300目濾網過濾以后，流式細胞儀檢測細胞周期變化。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞以0.25%的胰酶消化后，制成單細胞懸浮液，細胞密度為每毫升含有106個細胞，1 000 r/min離心10 min，用PBS將細胞沉淀懸浮洗滌2次，加入200 μl的Annexin V-FITC結合緩沖液將細胞懸浮，分別添加各5 μl的Annexin V-FITC和PI染液，以流式細胞儀測定每組乳腺癌細胞的凋亡情況。

1.8Western印跡檢測細胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27和線粒體、胞質中CytochromeC蛋白水平 Control組、siRNA control組、ZEB1 siRNA組細胞按照1.4中Western印跡方法檢測細胞中酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白水平，同時以Western印跡方法檢測線粒體、胞質中CytochromeC蛋白水平，線粒體和胞質蛋白提取參照線粒體、胞質蛋白提取試劑盒。酶切Caspase-3、cyclin E、p27蛋白表達水平以β-actin作為參照，線粒體中CytochromeC蛋白水平以VDAC1為內參，胞質中CytochromeC蛋白水平以β-actin為內參。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1成功構建沉默ZEB1的乳腺癌細胞 如圖1和表1中所示，乳腺癌細胞感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后，細胞中ZEB1 mRNA和蛋白表達水平均明顯降低，說明構建了沉默ZEB1的乳腺癌細胞，為后續研究提供了條件。

2.2沉默ZEB1可明顯降低乳腺癌細胞增殖能力 表2所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞A490值明顯降低，提示沉默ZEB1可以下調乳腺癌細胞的增殖能力。

圖1 Western印跡測定穩定感染慢病毒LV-ZEB1-siRNA后細胞中ZEB1蛋白水平

表1 乳腺癌細胞中ZEB1 mRNA和蛋白表達水平變化

與Control組比較：1)P<0.05，下表同

表2 沉默ZEB1后的乳腺癌細胞A490值變化

圖2 Western印跡檢測沉默ZEB1后的乳腺癌細胞中cyclinE、p27蛋白水平

2.3沉默ZEB1可阻礙乳腺癌細胞從G0/G1向S期進展 如圖2和表3中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞G0/G1期細胞比例明顯升高，同時細胞中cyclinE蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以誘導乳腺癌細胞周期阻滯。

表3 沉默ZEB1后的乳腺癌細胞周期分布和cyclinE、p27蛋白水平變化

2.4沉默ZEB1可明顯促進乳腺癌細胞凋亡 如圖3和表4中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞凋亡率明顯升高，同時細胞中酶切Caspase-3蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以誘導乳腺癌細胞凋亡發生。

2.5沉默ZEB1促進乳腺癌細胞線粒體釋放CytochromeC 如圖4和表5中所示，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞胞質中CytochromeC水平明顯升高，線粒體中CytochromeC水平明顯降低，說明沉默ZEB1可以促進乳腺癌細胞線粒體釋放CytochromeC。

圖3 Western印跡測定沉默ZEB1后乳腺癌細胞中酶切Caspase-3蛋白水平

表4 沉默ZEB1后的乳腺癌細胞凋亡率和酶切Caspase-3蛋白水平變化

圖4 Western印跡檢測沉默ZEB1的乳腺癌細胞線粒體和胞質中CytochromeC蛋白變化

表5 沉默ZEB1后的乳腺癌細胞線粒體和胞質中CytochromeC蛋白變化

3 討 論

ZEB1是具有抑制IL-2表達作用的鋅指結構蛋白，其基因定位在10p11.2染色體上在，含有多個剪切變異體，其含有兩個相鄰的鋅指簇，這兩個鋅指簇能夠特異性地同CACCT序列、CAGGTG序列結合，調控靶基因的轉錄〔8，9〕。兩個鋅指簇中間含有的結構域不參與DNA的結合，能夠與其他相關調節因子結合影響ZEB1功能發揮，另外ZEB1含有CID結構域，能夠與CtBP結合，促進染色質的凝聚，影響靶分子的轉錄〔10，11〕。ZEB1在成人的膀胱、子宮等中高表達，在胎兒的心臟、肺臟、甲狀腺中也具有較高水平的表達，ZEB1與腫瘤發生有關，其在膽囊癌、胰腺癌等腫瘤組織中表達水平較高，并且沉默ZEB1表達后可以發揮抑制腫瘤的作用〔12，13〕。目前在膀胱癌、結腸癌等腫瘤細胞中發現ZEB1表達下調可以抑制腫瘤細胞的生長、侵襲、遷移，同時還具有誘導細胞凋亡的作用〔14，15〕。在乳腺癌中的研究顯示，ZEB1下調可以抑制乳腺癌細胞的轉移潛能〔16〕。本實驗的結果顯示，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞增殖能力降低，細胞凋亡水平升高，說明沉默ZEB1具有抑制乳腺癌細胞生長誘導乳腺癌細胞凋亡的作用，這明確了ZEB1在乳腺癌細胞增殖凋亡中的作用，說明沉默ZEB1具有抗乳腺癌細胞的作用。

細胞周期是生命活動的基礎，細胞在細胞周期時相變化中發生增殖、分化、衰老等狀態，細胞周期主要分為G1期、S期、G2期和M期，細胞周期蛋白一共含有8個亞型，分別在不同的周期變化時呈現規律性的表達，其中cyclinE是哺乳動物中G1期調控蛋白，在G1期的晚期表達水平最高，能夠促進細胞進入S期，cyclin E是細胞周期進展的促進因子〔17～19〕。p27是細胞周期抑制蛋白，其可以通過末端的Thr位點阻礙周期蛋白功能發揮，高表達p27能夠使細胞停滯在G1期〔20〕。研究顯示，ZEB1敲減可以將脂肪間充質干細胞周期阻滯在G1期，抑制細胞增殖能力，后續在胰腺癌、大腸癌中的研究顯示，ZEB1敲減可能通過阻滯G1期進展降低癌細胞增殖能力〔21～23〕。本實驗表明，沉默ZEB1后的乳腺癌細胞G1期比例升高，細胞中cyclin E蛋白水平降低，p27蛋白水平升高，說明沉默ZEB1可以將乳腺癌細胞阻滯在G1期。

細胞凋亡機制較為復雜，其中包括線粒體途徑、內質網途徑、死亡受體途徑等，線粒體途徑是發現較早的一種凋亡發生機制，其發生的關鍵是線粒體內CytochromeC的釋放，正常情況下，CytochromeC主要存在于線粒體內，在受到外界因素的刺激以后，線粒體中的CytochromeC進入到胞質內，激活下游Caspase級聯反應，誘導細胞凋亡發生，CytochromeC進入胞質是線粒體凋亡途徑發生的關鍵因素〔24～26〕。本實驗的結果顯示，沉默ZEB1可以促進線粒體中CytochromeC進入胞質，誘導細胞中凋亡執行因子Caspase-3的活化，誘導細胞凋亡發生，這提示沉默ZEB1可以通過線粒體途徑誘導乳腺癌細胞凋亡。

總之，沉默ZEB1具有抗乳腺癌的作用，其可以抑制乳腺癌細胞的生長，阻滯乳腺癌細胞周期，誘導乳腺癌細胞凋亡，這為以后研究ZEB1在乳腺癌發生中的作用奠定了基礎，為基因靶向治療乳腺癌提供了思路。