抑制紫色素桿菌12472群感效應放線菌的篩選

穆永其，曾 紅，陳 偉,2

(1.塔里木大學 生命科學學院，新疆兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學 動物科學學院，新疆兵團塔里木畜牧科技重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

由于抗菌藥物的濫用，細菌耐藥問題日趨嚴重，使新抗生素的產生速度遠低于細菌耐藥性的產生速度。以直接殺死微生物或抑制其生長的傳統靶點和篩選方法獲得的抗生素，無法從根本上解決細菌耐藥性的問題[1]。細菌耐藥性是由群感效應控制的，其調控細菌色素產生、毒力基因表達、生物膜形成等[2]。因此，研發不抑菌抑制群感效應(Quorum sensing，QS)的新型藥物，有望改良細菌耐藥性問題，已成為當今生命科學研究的重點。

越來越多的研究表明，細菌耐藥性與生物膜形成有關[3]。許多細菌由于具有形成生物膜的能力而對抗生素產生耐藥性[4]。而QS則是控制生物膜形成的重要機制[5]。因此，尋找群感效應抑制劑(QS inhibitors，QSI)有望從新的角度解決細菌耐藥性問題。本研究以源自新疆南疆地區的放線菌為材料，紫色素桿菌ATCC 12472為靶標菌，篩選群感效應抑制劑，為以QS為靶標的新型藥物研發提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養基

1.1.1 菌株 紫色素桿菌ATCC 12472 由中國海洋大學饋贈。170 株新疆南疆地區放線菌均來自兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室。

1.1.2 培養基 高氏一號培養基：淀粉 20.0 g，KNO31.0 g，FeSO40.01 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌 30 min。

Am6培養基：淀粉 20.0 g，葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 5.0 g，酵母浸膏 5.0 g，CaCO35.0 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0，115 ℃滅菌 30 min。

LB培養基：胰蛋白胨 10.0 g，酵母提取物 5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂 16.0 g，pH 7.0～7.5，121 ℃滅菌 30 min。

1.2 放線菌菌株活化及發酵

將保藏的放線菌，菌液涂布于固體平板上，37 ℃恒溫倒置培養 3～7 d 進行活化，觀察菌落生長情況。在生長良好的固體平板菌上用藍槍頭打菌餅，接種于 500 mL、裝液量為150 mL的種子培養基中(每瓶接 5～10 個菌餅)，30 ℃、180 r/min 培養 5～7 d。將生長良好的種子液按4%的接種量接種于 500 mL、裝液量為 150 mL 的發酵培養基中，30 ℃、180 r/min 培養 7 d，同時觀察菌體生長情況。發酵液 12 000 r/min 離心 15 min，取上清，0.45 μm 微孔濾膜無菌過濾，去除菌體后，-20 ℃貯藏，備用[6]。

1.3 放線菌發酵液對紫色素桿菌12472群感效應的影響

采用微量板半定量法[7]檢測放線菌發酵液對ChromobacteriumviolaceumATCC 12472 群感效應抑制能力：按 1∶100 的接種比例將過夜培養的 12472 菌液 100 μL，接種至 10 mL LB培養基中，振蕩搖勻。配制最終體積分數為50%的發酵液與菌液的混合液，吸取 200 μL 混合液至 96 孔細胞培養板中，每株接種 4 孔。每一培養板中同時設對照(等體積的 12472 菌液)與空白對照(等體積的 LB 培養基)各 4 孔。30 ℃ 恒溫靜置培養 24 h 后，取出 96 孔細胞培養板觀察色素產生情況。用酶標儀測 OD590，檢測紫色素桿菌的生長情況。所有試驗均在不同時間重復 3 次。

1.4 紫色桿菌素定量方法

按Choo等[8]的方法測量紫色桿菌素：吸取1 mL培養好的菌液于1.5 mL離心管中，13 000 r/min 離心 10 min，使紫色桿菌素和菌體充分沉淀。去掉上清液，加 1 mL 二甲亞砜(DMSO)于離心管中，渦旋充分振蕩，使紫色桿菌素溶解于DMSO 中。13 000 r/min 再次離心10 min，沉淀菌體及碎屑。測定上清 OD585nm處的光吸收值。

1.5 放線菌的分子生物學鑒定

參照文獻[9]介紹的方法，PCR擴增放線菌的16S rDNA基因，送測序公司測序后比對。

2 結果與分析

2.1 抑制紫色素桿菌12472色素產生的放線菌篩選

從170株新疆南疆地區放線菌中篩選抑制紫色素桿菌12472色素產生的菌株。用微孔板半定量法初篩，選出抑制效果最好的有37株，占檢測總菌株數的 21.74%；抑制效果適中的有22株，占檢測總菌株數的 12.94%；抑制效果最差的有52株，占檢測總菌株數的 30.59%；促進紫色經過多次發酵復篩，選出活性穩定、抑制紫色素桿菌12472色素產生效果最好的放線菌菌株5株(圖2)，分別為TRM10325、10303′、20813、10311、11402。用紫色桿菌素定量方法，定量經發酵液處理后紫色素桿菌產色素能力的改變情況。其中放線菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402的發酵液使紫色素桿菌12472產色素能力分別降低75.13%、65.46%、68.61%、84.72%和70.21%。

素桿菌生長的有45株，占檢測總菌株數的 26.47%；抑制紫色素桿菌生長的有14株，占檢測總菌株數的 8.24%(圖1)。

圖1 170 株放線菌抑制紫色素桿菌色素產生能力檢測Fig.1 Performance of 170 actinomycetes strains on violacein production of C.violaceum ATCC12472

2.2 菌株鑒定

根據 16S rDNA 構建的系統發育樹[10](圖3)。測序結果在 NCBI 中比對[11]，顯示5株菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402均為鏈霉菌屬。

圖2 5株放線菌發酵液對紫色桿菌素產生的抑制Fig.2 Inhibition of violaceum production by five strains of actinomyces extract

圖3 5株鏈霉菌TRM10325、10303′、20813、10311、11402 基于16S rDNA鄰接法系統發育樹Fig.3 The 16S rDNA Neighbor-joining phylogenetic tree of strain TRM10325,10303′,20813,10311,11402

3 討 論

選取兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室從新疆南疆地區分離鑒定的放線菌，篩選抑制紫色素桿菌12472色素產生的活性菌株。經過反復驗證，得到5株不抑菌、但抑制其紫色桿菌素產生的放線菌，分別為TRM10325、10303′、20813、10311、11402，經鑒定5株菌均為鏈霉菌屬。

在試驗初期發現紫色素桿菌12472不易存活，因此對其存活時間進行摸索。發現轉接于固體培養基上的菌存活時間為16 d，在存活12 d以內活性最好。轉接液體培養基中的菌存活時間約為13 d，在存活11 d以內活性最好。因此，從存活時間的長度來看，轉接自固體培養基上的菌存活時間更久，所以在做活性驗證試驗時，會優先選擇固體培養基上培養的紫色素桿菌。而關于紫色素桿菌12472存活時間的試驗，尚未見文獻報道。

從試驗中發現，不抑制菌生長、但抑制其紫色桿菌素的產生，主要有3種情況：①菌體正常生長，但幾乎是無色的，只有微量的紫色桿菌素產生。②菌體正常生長，紫色桿菌素恢復的很快，24 h 后就恢復正常的紫色。③菌體正常生長，紫色桿菌素恢復較慢，24 h后只有薄薄的紫色。過幾天后，紫色又會恢復正常。為了排除抑菌導致紫色桿菌素減少的情況，做如下處理：首先用酶標儀測OD590，與紫色素桿菌的對照組進行比較，看菌體生長量是否下降，下降證明抑菌；其次用觀察法驗證，抑菌的孔一般是透亮的，而有菌體生長的孔呈渾濁。

本試驗所用的微孔板半定量法是篩選 QSI 的有效方法，其中用96孔板法篩選紫色素桿菌QSI，目前尚未見報道。用微孔板半定量法對放線菌發酵液進行群感效應抑制活性的篩選，得到37株不抑菌，但抑制紫色素桿菌12472色素產生的放線菌菌株，其中TRM10325、10303′、20813、10311、11402等5株菌，經過反復驗證，抑制活性較好。在后續的試驗中，將對活性放線菌進行大批量發酵，分離純化單體活性化合物，探究其抑制機制，希望能為細菌感染提供新的治療策略，并為研發新藥提供試驗依據。