CS-5100全自動(dòng)血凝儀檢測(cè)抗凝血酶Ⅲ、蛋白C、蛋白S活性的性能驗(yàn)證

李 雯，何愛麗， 張 雯，周 挺

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西 西安 710004）

抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，ATⅢ）是人體內(nèi)主要的生理性血漿抗凝物質(zhì)，主要由肝臟合成。血液中抗凝血酶與凝血酶結(jié)合形成凝血酶—抗凝血酶復(fù)合物[1]，從而滅活凝血酶，起到控制血液凝固的作用。蛋白C（protein C，Pc）系統(tǒng)在凝血酶產(chǎn)生的同時(shí)被激活，滅活FVa和FⅧa，阻斷凝血過(guò)程；蛋白S（protein S，Ps）是一種維生素K依賴性酶原，可協(xié)同活化Pc，抑制血液凝固。因此，檢測(cè)ATⅢ、Pc和Ps活性狀態(tài)對(duì)血栓性疾病、心肌梗死、腦血管疾病、彌散性血管內(nèi)凝血、肝臟疾病、腎病綜合征、外科手術(shù)以及抗凝藥物的檢測(cè)都具有重要意義。本研究根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）系列指南文件對(duì)CS-5100全自動(dòng)血凝儀（簡(jiǎn)稱CS-5100）及配套試劑檢測(cè)ATⅢ、Pc和Ps活性進(jìn)行性能驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)選取在西安市交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診的患者及體檢健康者，參照 CLSI H21-A5文件[2]的要求，用0.109 mmol /L 檸檬酸鈉抗凝管采集患者靜脈血2 mL，1 500×g離心10 min，分離出乏血小板血漿，要求標(biāo)本無(wú)溶血、凝固、乳糜現(xiàn)象，血細(xì)胞比容＜55%。

1.2 儀器與試劑

CS-5100（日本Sysmex公司）及配套試劑。正常水平定值質(zhì)控品批號(hào)為507722，異常水平定值質(zhì)控品批號(hào)為509986，ATⅢ試劑批號(hào)為 45762，Pc試劑批號(hào)為 45888，Ps試劑批號(hào)為45769。

1.3 性能驗(yàn)證方法

1.3.1 不精密度[以變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）表示]驗(yàn)證 （1）批內(nèi)不精密度：參照CLSI EP15-A2文件要求[3]，取2個(gè)水平的混合血漿，按照常規(guī)方法連續(xù)測(cè)定20次ATⅢ、Pc和Ps，計(jì)算各項(xiàng)目的x 、s和CV。（2）日間不精密度：取2個(gè)水平的混合血漿，各分裝成5份標(biāo)本，保存于-70 ℃，每天測(cè)定4次，分2批測(cè)定，每批間隔時(shí)間2 h，連續(xù)測(cè)定5 d，記錄每次 ATⅢ、Pc和Ps的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算CV。按照廠家標(biāo)準(zhǔn)，要求ATⅢ活性批內(nèi)不精密度 ＜1.3%，日間不精密度＜2.7%，Pc活性批內(nèi)不精密度 ＜0.4%，日間不精密度＜1.9%，Ps活性批內(nèi)不精密度＜1.9%，日間不精密度＜4.1%。

1.3.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 參照廠家提供的定值質(zhì)控品使用說(shuō)明書，使用1.0 mL的注射用水將正常和異常2個(gè)水平的定值質(zhì)控品進(jìn)行復(fù)溶，混勻，室溫（25±2）℃穩(wěn)定20～30 min后進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)參照CLSI EP15-A2文件要求[3]，重復(fù)測(cè)定ATⅢ、Pc和Ps2個(gè)水平的定值質(zhì)控品各3次，將測(cè)定值與靶值進(jìn)行比較，計(jì)算相對(duì)偏移，相對(duì)偏移=（靶值-測(cè)定值）/靶值×100%。查閱Westgard生物學(xué)CV要求，ATⅢ活性偏移±4%，Pc活性偏移±13.9%，Ps活性偏移±15.9%。

1.3.3 線性驗(yàn)證 參照CLSI EP6-A文件[4]，選取高、低2個(gè)水平的混合血漿，將低水平和高水平標(biāo)本分別按4∶0、3∶1、2∶2、1∶3、0∶4的比例混合，得到5份線性試驗(yàn)標(biāo)本，每個(gè)稀釋度重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算x。 將5對(duì)實(shí)測(cè)值與理論值作直線回歸，得到回歸方程Y=aX+b和r2值。回歸方程斜率在（1±0.05）范圍內(nèi)、r2≥0.95判定為合格。

1.3.4 參考區(qū)間驗(yàn)證 廠家試劑說(shuō)明書提供的參考區(qū)間分別為ATⅢ79.4%～112.0%、Pc 70.0%～140%、Ps 60.0%～130.0%。參照CLSI C28-A2文件[5]，收集20名體檢健康者血漿，排除伴有血液系統(tǒng)疾病、心腦血管疾病、肝臟疾病、肺栓塞、服用抗凝藥物者，測(cè)定標(biāo)本并計(jì)算R值（R=結(jié)果落在參考區(qū)間內(nèi)的樣本數(shù)/總樣本數(shù)），以R≥0.9為驗(yàn)證通過(guò)。

1.3.5 攜帶污染驗(yàn)證 參照CLSI H57-A文件[6]，高值標(biāo)本污染：將低值標(biāo)本（N）置于1和3 位置，高值標(biāo)本（A）置于2位置，每個(gè)標(biāo)本測(cè)3次，記錄結(jié)果，分別標(biāo)注為N1、N2、N3、A1、A2、A3 、N4、N5、N6。攜帶污染率=[N4-x（N1，N2，N3）] /x （N1，N2 ，N3）。尚未查到對(duì)3種抗凝蛋白活性檢測(cè)攜帶污染率有要求的指南性文件，僅有相關(guān)血凝儀性能驗(yàn)證文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道各項(xiàng)目CV＜10%。因此以攜帶污染率＜10%為符合要求。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證

ATⅢ、Pc和Ps批內(nèi)不精密度和日間不精密度驗(yàn)證結(jié)果均符合試劑說(shuō)明書要求。見表1。

2.2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證

ATⅢ、Pc和Ps各項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果均落在質(zhì)控品標(biāo)示的允許范圍內(nèi)，偏移符合Westgard生物學(xué)CV要求。見表2。

表1 批內(nèi)及日間不精密度驗(yàn)證 （%）

表2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證 （%）

2.3 線性驗(yàn)證

ATⅢ線性驗(yàn)證試驗(yàn)理論值和實(shí)測(cè)值的回歸方程為Y=0.980 1X-0.259，r2=0.999 7。Pc線性驗(yàn)證試驗(yàn)理論值和實(shí)測(cè)值的回歸方程為Y=0.970 4X+0.986，r2=0.996 7。Ps線性驗(yàn)證試驗(yàn)理論值和實(shí)測(cè)值的回歸方程為Y=0.982 2X+2.789 4，r2=0.994 5。均符合線性回歸方程的斜率在（1±0.05）范圍內(nèi)以及r2≥0.95的要求。見圖1～圖3。

2.4 參考區(qū)間驗(yàn)證

20名體檢健康者ATⅢ、Pc、Ps的檢測(cè)結(jié)果均在廠家試劑說(shuō)明書提供的參考區(qū)間內(nèi)，驗(yàn)證通過(guò)。見表3。

2.5 攜帶污染試驗(yàn)

ATⅢ高值對(duì)低值的污染所引起的相對(duì)偏差為0.71%，Pc高值對(duì)低值的污染所引起的相對(duì)偏差為-0.63%，Ps高值對(duì)低值的污染所引起的相對(duì)偏差為1.11%，攜帶污染率可接受。見表4。

圖1 ATⅢ的線性驗(yàn)證

圖2 PcⅢ的線性驗(yàn)證

圖3 Ps的線性驗(yàn)證

表3 參考區(qū)間驗(yàn)證 （%）

表4 高值樣本對(duì)低值樣本的攜帶污染率 （%）

3 討論

血栓形成是導(dǎo)致心、腦和外周血管事件的最后關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是致死或致殘的直接原因。血栓性疾病幾乎涵蓋所有臨床科室，其發(fā)病率高居各種疾病之首。在血栓性疾病中，靜脈血栓的發(fā)生率比動(dòng)脈血栓高4倍，但只有11%～15%的患者在生前被明確診斷。大多數(shù)靜脈血栓沒有癥狀，易被漏診、誤診。 ATⅢ、Pc和Ps活性檢測(cè)的開展對(duì)于血栓性疾病，尤其對(duì)于易栓癥的臨床篩查具有重要意義。易栓癥并不一定指疾病，可以是生理或病理狀態(tài)，是指存在抗凝蛋白、凝血因子、纖溶蛋白等遺傳性或獲得性缺陷，或者存在獲得性危險(xiǎn)因素而具有高血栓栓塞傾向[9]。易栓癥的血栓栓塞類型主要為靜脈血栓栓塞癥（venous thromboembolism，VTE）。在我國(guó)，最常見的易栓癥類型是遺傳性易栓癥。有研究對(duì)672例VTE患者的相關(guān)危險(xiǎn)因素進(jìn)行了分析，其中有94例VTE患者檢測(cè)了抗凝蛋白，Pc缺乏占13.85%、Ps缺乏占5.3%、AT缺乏占5.3%，合計(jì)占24.4%[10]。因此，ATⅢ、Pc和Ps的活性檢測(cè)對(duì)易栓癥篩查具有重要意義。而國(guó)內(nèi)大多數(shù)醫(yī)院對(duì)易栓癥的篩查還停留在常規(guī)凝血4項(xiàng)和空腹同型半胱氨酸以及抗磷脂抗體的檢測(cè)上，僅有部分醫(yī)院開展ATⅢ、Pc和Ps的活性以及凝血因子的檢測(cè)。

本研究參考CLSI系列指南文件對(duì)CS-5100及配套試劑檢測(cè)ATⅢ、Pc和Ps活性的性能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示ATⅢ、Pc和Ps的批內(nèi)不精密度和日間不精密度均符合廠家要求，檢測(cè)重復(fù)性良好。準(zhǔn)確度為一種定性的概念，有報(bào)道[11]指出準(zhǔn)確度驗(yàn)證的定值參考物來(lái)源主要有以下4種：（1）可溯源至美國(guó)病理學(xué)家協(xié)會(huì)及美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院的定值新鮮冰凍人血清；（2）實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評(píng)物；（3）從能力比對(duì)實(shí)驗(yàn)中獲得的參考物；（4）廠家提供的正確度確認(rèn)物或質(zhì)控物。本研究采用第4種，重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算偏移。在線性評(píng)價(jià)驗(yàn)證中，本研究參照CLSI EP6-A指南[4]，采用多項(xiàng)式回歸作為分析線性的評(píng)價(jià)方法，結(jié)果表明ATⅢ、Pc和Ps實(shí)測(cè)值和理論值之間具有良好的線性關(guān)系。參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果顯示，20名體檢健康者的ATⅢ、Pc和Ps的檢測(cè)結(jié)果均在廠家說(shuō)明書提供的參考區(qū)間內(nèi)，參考區(qū)間驗(yàn)證通過(guò)。但應(yīng)注意的是，接受實(shí)驗(yàn)室的操作必須和原始參考值研究的分析前和分析中各因素盡量保持一致，否則參考區(qū)間轉(zhuǎn)移毫無(wú)意義。攜帶污染率是指樣本檢測(cè)間以及試劑間引起攜帶污染的概率，本研究?jī)H驗(yàn)證了主要樣本間的攜帶污染率。結(jié)果顯示ATⅢ、Pc和Ps的攜帶污染率分別為0.71%、-0.63%和1.11%。

CS5100性能驗(yàn)證報(bào)道很多，但對(duì)ATⅢ、Pc和Ps性能驗(yàn)證較少。目前尚未查到國(guó)內(nèi)外在ATⅢ、Pc和Ps活性檢測(cè)性能驗(yàn)證和質(zhì)量控制方面的指南性文件。因此，期望相關(guān)指南文件不斷完善，使各級(jí)實(shí)驗(yàn)室抗凝蛋白活性性能驗(yàn)證能規(guī)范化開展，為臨床提供可靠的檢測(cè)結(jié)果。