血清總同型半胱氨酸候選參考測量程序（液相色譜串聯質譜法）的建立及性能評估

沈 敏， 楊曉東， 王 琳， 鄒繼華， 張 曼， 鄒炳德

（1. 美康生物參考實驗室，浙江 寧波 315104；2. 首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院檢驗科，北京 100038）

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是人體內蛋氨酸和半胱氨酸代謝的重要中間產物[1]。正常人體內Hcy濃度為5～15 μmol/L。由于遺傳或者其他因素使人體內Hcy濃度持續高于正常值，即出現高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）。近年來的研究結果表明，HHcy是心腦血管疾病的獨立危險因素[2-3]；同時，Hcy與冠狀動脈疾病[4-5]、腦血管疾病[6-7]、糖尿病大血管病變[8]及靜脈血栓形成[9-10]等多種疾病有著非常重要的關系。因此，開展Hcy普查對于某些疾病的預防、診斷及治療具有非常重要的意義。血漿Hcy主要包括3種形式[11]：70%～80%為蛋白結合型Hcy，20%～30%為Hcy二聚物或混合Hcy，只有1%為游離型Hcy。臨床上通常檢測的是總Hcy。

目前，總Hcy的檢測方法較多，包括循環酶法、熒光偏振法、酶聯免疫法、高效液相色譜（high-performance liquid chromatography，HPLC）-電化學法、HPLC-熒光法、氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，G C-M S）及液相色譜串聯質譜（l i q u i d chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）等[12-17]。在這些方法當中，生化法和免疫法雖然具有全自動、快速的優點，但其試劑昂貴，特異性較差，且檢測結果的準確性和重復性不佳。HPLC、GC-MS雖然準確度較高，但樣本需要進行衍生化等步驟處理，操作比較復雜且耗時。LC-MS/MS由于具有敏感性高、特異性好、準確度高等突出優點，近年來已被用于總Hcy的臨床檢測。

臨床檢驗參考方法廣泛應用同位素稀釋質譜（isotope-dilution mass spectrometry，IDMS）原理，在檢驗醫學溯源性聯合委員會（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM） 2006年公布的國際臨檢參考方法列表中，有機小分子檢驗項目57種參考方法中有52種基于ID-MS原理[18]。總Hcy檢測的參考方法也是基于ID-MS原理。目前，在JCTLM列表上公布的總Hcy參考方法有3種[19-20]，均由美國國家標準與技術研究院（the National Institute of Standards and Technology，NIST）開發，對血清或血漿中總Hcy的檢測結果比較理想。但由于其選用的標準物質為DL-高胱氨酸，同位素內標為氘8-高胱氨酸，二者分子結構均為2分子Hcy的巰基通過共價二硫鍵結合而成，需要對二者各自進行還原，才能進行準確定量，而該還原過程操作較為繁瑣且耗時。因此，本研究在此基礎上，直接以Hcy單體作為標準物質，以氘4-Hcy作為內標，進一步優化色譜和質譜檢測條件，以期能基于LC-MS/MS技術建立一種簡單、準確且穩定的候選參考測量程序，以實現血清總Hcy項目的量值傳遞，保證臨床常規檢測系統測量結果的準確性。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯質譜系統（美國SCIEX公司）、SUPELCOSIL LC-CN 色譜柱（250 mm×4.6 mm，粒徑5 μm，美國SUPELCO公司）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Heidolph Multi Reax漩渦混合器（德國Heidolph公司）、Eppendorf 5427R高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、Eppendorf移液器（德國Eppendorf AG公司）、容量瓶（日本ASone公司）、Milli-Q超純水系統（德國Millipore公司）。

DL-Hcy（即Hcy標準品）純度為95.6%，購自美國Sigma公司；同位素內標DL-Hcy-2H4（簡稱Hcy-d4）購自美國IsoSciences公司，純度為98.88%，同位素豐度為99.72%；正確度驗證標準物質SRM 1950購自NIST；DL-二硫蘇糖醇（薄層色譜級）和三氟乙酸（色譜級）購自美國Sigma公司；甲醇（Optima LC/MS級）、甲酸（Optima LC/MS級）、乙腈（Optima LC/MS級）均購于美國Thermo Fisher公司。實驗用水采用Milli-Q超純水系統制備。

1.2 方法

1.2.1 標準品與內標品制備 用重量法分別精密稱取Hcy標準品、Hcy-d4內標，加水溶解并稀釋混勻，分別制備出500 μmol/L Hcy標準儲備液和100 μmol/L Hcy-d4標準儲備液，避光2～8 ℃密封保存。精密稱取不同質量的Hcy標準儲備液，加入水稀釋并混勻，分別制備出0.5、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L共9個濃度梯度的Hcy標準工作液；同理，制備出10.0 μmol/L Hcy-d4標準工作液。以上溶液需計算溶液密度（g/mL），避光2～8 ℃密封保存。

1.2.2 樣本前處理 用重量法移取不同濃度的Hcy標準工作液或血清樣本100 μL 于1.5 mL離心管中，加入100 μL Hcy-d4標準工作液（重量法），然后再加入20 μL DL-二硫蘇糖醇溶液，渦旋混合2 min后室溫平衡15 min，加入200 μL乙腈[含0.05%三氟乙酸（V∶V）、0.1%甲酸（V∶V）]溶液，渦旋混合2 min后13 000×g離心5 min，取上清100 μL加入到進樣瓶中，加入900 μL 10%甲醇（V∶V）水溶液稀釋至1 mL，混勻，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為SUPELCOSIL LC-CN色譜柱，流動相A為0.1%甲酸甲醇溶液（V∶V），流動相B為0.1%甲酸水溶液（V∶V），流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為3 μL，梯度洗脫（0→7 min，10%A；7→9 min，10%A→100%A；9→12 min，100%A；12→13 min，100%A→10%A；13→15 min，10%A）。

1.2.4 質譜分析條件 離子源為電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI），離子化方式為正離子模式，離子化電壓為5 500 V，霧化溫度為550 ℃，碰撞氣強度為Medium，氣簾氣、霧化氣和輔助加熱氣分別為35 psi、55 psi、40 psi。以多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式掃描分析。具體參數見表1。

1.3 方法性能評估

參照美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）C62-A文件[21]和C50-A文件[22]對建立的LC-MS/MS方法進行基本分析性能驗證。

表1 質譜測定參數設置

1.3.1 標準曲線與線性評價 用重量法各取9個濃度梯度的Hcy標準工作液（0.5、2.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）100 μL，按照樣本前處理條件進行相同處理，每個濃度重復檢測2次，取均值。各濃度的檢測偏移＜15%， 且r＞0.99可判斷為呈線性。

1.3.2 檢測限與定量限 用生理鹽水對已知濃度的高濃度（10.91 nmol/g）血清樣本進行稀釋，制備包括預期的定量限濃度在內的3個濃度梯度的稀釋樣本，混勻，分別計算出每個濃度梯度樣本的理論濃度（C1），然后將定量限樣本各一式五份進行處理后檢測，得到實際測定值（C2）。將同時滿足偏移 ＜20%、變異系數（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）≥1 0的濃度值定義為定量限，將S/N=3的計算濃度值定義為檢測限。

1.3.3 基質效應 采用基質混合實驗的方法來檢測相對基質效應，即通過檢測血清基質樣本、溶液基質標準溶液、血清和溶液1∶1（質量比）混合物、血清和溶液80∶20（質量比）混合物、血清和溶液20∶80（質量比）混合物這5種基質樣本（各5份）中標準與內標的峰面積比值來計算相對基質效應。第1組：100 μL標準工作液+100 μL內標，共5份樣本，經前處理進樣得到標準與內標峰面積比值的平均值A；第2組：100 μL血清+100 μL內標，共5份樣本，經前處理進樣得到標準與內標峰面積比值的平均值B；第3組：50 μL血清+50 μL標準工作液+100 μL內標，共5份樣本，經前處理進樣得到標準與內標峰面積比值的平均值C；第4組：80 μL血清+20 μL標準工作液+100 μL內標，共5份樣本，經前處理進樣得到標準與內標峰面積比值的平均值D；第5組：20 μL血清+80 μL標準工作液+100 μL內標，共5份樣本，經前處理進樣得到標準與內標峰面積比值的平均值E。以上操作均用重量法。1∶1混合物相對基質效應 =[C-（A+B）/2]/[（A+B）/2]×100%；80∶20混合物的相對基質效應=[D-（0.2A+0.8B）]/（0.2A+0.8B）×100%；20∶80混合物的相對基質效應=[E-（0.8A+0.2B）]/（0.8A+0.2B）×100%。如果3種混合物中標準與內標的峰面積比值與對應比例血清基質樣本和溶液基質標準溶液中標準與內標的峰面積比值的均值差異 ＜20%，則視為無相對基質效應。

1.3.4 攜帶污染 在評估攜帶污染時，先重復進樣低值樣本（定量限濃度樣本），然后交替進樣高值（79.56 nmol/g）樣本（H）和低值0.31 nmol/g樣本（L），進樣順序如下：L1、L2、L3、H1、H2、L4、H3、H4、L5、L6、L7、L8、H5、H6、L9、H7、H8、L10、H9、H10、L11。比較第1次進樣（L1）后跟隨的低值樣本檢測結果的平均值A（即L2、L3、L6、L7、L8的平均值）與隨后進樣的高值樣本后跟隨的低值樣本檢測結果的平均值B（即L4、L5、L9、L10、L11的平均值）的差異，若低于預定標準[以20%為限，攜帶污染率=（B-A）/A×100%]，則認為在測定該高值及以下濃度時不存在明顯的攜帶污染。

1.3.5 精密度評價 采用低（11.29 μmol/L）、中（48.83 μmol/L）、高（81.86 μmol/L）3個濃度的混合血清作為待測樣本，將混合血清分裝后-70 ℃保存，對每個濃度樣本每批次各5份進行樣本前處理，連續測定3個批次，分別計算批內CV和批間CV。

1.3.6 正確度驗證 分別采用加標回收和測定有證參考物質2種方式對方法的正確度進行評價。（1）加標回收實驗：取3個已知濃度（10.91、47.60、79.56 nmol/g）的混合血清，采用重量法各取0.5 mL，加入50.58 μmol/L Hcy標準工作液0.5 mL（重量法），混勻，制備出3個濃度的加標樣本，分別計算出理論濃度，然后將各個濃度的加標樣本（各5份）進行處理后進樣檢測，得到實際測定值，計算加標回收率。回收率在95%～105%之間為可接受。（2）有證參考物質測定：采用本研究建立的LC-MS/MS方法測定NIST SRM 1950，對每個批次5份樣本進行前處理，連續測定2個批次，考察方法的正確度。

1.3.7 穩定性 目標分析物的穩定性對檢測結果的影響非常大，必須對其加以評估。以精密度驗證樣本中的低濃度血清樣本為穩定性研究樣本，通過以下2個方面評估目標分析物的穩定性：（1）在生物基質中的穩定性，包括室溫放置4～24 h的穩定性、2～8 ℃保存1～4 d的穩定性及反復凍融的穩定性；（2）處理后樣本的穩定性，包括處理后室溫放置4～24 h的穩定性、處理后自動進樣器放置4～24 h的穩定性。

1.4 不確定度評估

依據《測量不確定度表示指南》（Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement，簡稱GUM），測量結果的濃度計算公式為C=（A/AIS-b）/k×fc×fm，式中C為總Hcy的測量濃度（μmol/L）、A/AIS為樣本與內標的峰面積比值、b為標準曲線截距、k為標準曲線斜率、fc為標準與內標溶液濃度修正因子、fm為樣本處理修正因子。從標準工作液配制、樣本處理、儀器檢測及重復測量4個方面分析不確定度來源，并量化各個分量。

2 結果

2.1 標準曲線與線性評價

LC-MS/MS檢測血清總Hcy的色譜圖見圖1，標準曲線見圖2，線性范圍為0.5～200.0 μmol/L。

圖1 Hcy和Hcy-d4的色譜圖

圖2 LC-MS/MS檢測血清總Hcy的標準曲線

2.2 檢測限與定量限

LC-MS/MS檢測血清總Hcy的定量限為0.31 nmol/g，檢測限為0.06 nmol/g。見表2。

2.3 基質效應

采用基質混合實驗考察相對基質效應。5份溶液基質樣本的峰面積比值分別為0.907、0.920、0.920、0.920、0.920，平均值為0.917。5份血清基質樣本的峰面積比值分別為1.030、1.033、1.047、1.040、1.033，平均值為1.037。5份1∶1混合物樣本的峰面積比值分別為0.970、0.953、0.957、0.957、0.953，平均值為0.958。5份80∶20混合物樣本的峰面積比值分別為0.993、0.998、0.987、1.003、0.995，平均值為0.995。5份20∶80混合物樣本的峰面積比值分別為0.924、0.925、0.919、0.923、0.922，平均值為0.923。計算得到相對基質效應分別為1.94%、1.91%、1.78%。

2.4 攜帶污染

通過多次高值樣本和低值樣本交替重復進樣，計算得攜帶污染率為2.86%，因此可認為該方法不存在明顯的攜帶污染。

2.5 精密度評價

采用LC-MS/MS定量檢測混合血清總Hcy濃度，批內、批間CV分別為＜2%和＜1%，見表3。

2.6 正確度驗證

2.6.1 加標回收實驗 加標后3種濃度的血清樣本平均回收率分別為99.8%、100.2%、100.8%，準確度符合要求，見表4。

表2 Hcy的定量限評估結果

表3 LC-MS/MS精密度評價結果

表4 加標回收率測定結果

2.6.2 參考物質測定 采用NIST SRM 1950標準物質[證書濃度為（8.50±0.20）μmol/L]進行正確度驗證，連續測定2個批次，其測定均值、CV和偏移分別為8.55 μmol/L、1.65%、0.59%和8.49 μmol/L、1.35%、-0.12%，具有很高的正確度。

2.7 穩定性

2.7.1 在生物基質中的穩定性 低濃度血清樣本在室溫[（23±2 ）℃]放置24 h、2～8 ℃放置4 d、反復凍融5次的情況下穩定。

表5 生物基質樣本中Hcy的穩定性

2.7.2 處理后樣本的穩定性 樣本處理后室溫[（23±2 ）℃]放置24 h和自動進樣器（溫度為10 ℃）放置24 h均非常穩定。

表6 處理后樣本中Hcy的穩定性

2.8 不確定度評估

從標準工作液配制、樣本處理、儀器檢測及重復測量4個方面評估精密度實驗測定的3種濃度樣本測量結果的不確定度。結果顯示候選參考測量程序測定血清總Hcy濃度產生的不確定度較為合理。見表7。

表7 3種不同濃度樣本測定結果不確定度的評估結果

3 討論

HHcy是心腦血管疾病的獨立危險因子。體內Hcy濃度升高與神經系統疾病、高血壓、糖尿病、腎病、孕婦流產、新生兒缺陷等多種疾病有關。目前，臨床上已經將Hcy列為多種疾病診斷的重要指標。快速、準確地檢測體內Hcy濃度可以為某些疾病的預防、診斷及治療提供依據。因此，開發出快速、精準的檢測方法顯得尤為重要。LC-MS/MS結合了液相色譜分離與質譜質量分離的優點，敏感性高、特異性好。基于同位素稀釋的LC-MS/MS保證了檢測結果的準確度和精密度，近年來已被用于總Hcy的臨床檢測。

本研究基于JCTLM公布的總Hcy參考測量程序，建立一種簡單、準確且穩定的候選LC-MS/MS參考測量程序。在標準物質和同位素內標的選擇上，NIST選用的標準物質為DL-高胱氨酸，同位素內標為氘8-高胱氨酸，而本研究選擇Hcy單體作為標準物質，氘4-Hcy作為同位素內標，無需還原步驟，直接以此建立標準曲線進行定量。LC-MS/MS檢測總Hcy的過程涉及3個關鍵步驟：樣本前處理、色譜條件和質譜條件的選擇。在樣本的前處理上，本研究選擇以二硫蘇糖醇為還原劑，在NIST參考方法的基礎上對其濃度和加入量進行了微調，以保證所有結合型Hcy全部還原為游離型；同時，延長了蛋白沉淀后的離心時間，在保證檢測敏感性的前提下對上清液進行了稀釋，以減小基質效應的影響。在色譜條件的選擇上，本研究選用的色譜柱、流動相、柱溫、流速與NIST參考方法保持一致，但對其梯度洗脫程序進行了優化，降低了流動相中水相的初始比例，同時減緩了梯度，以減小各種內源性干擾物質對目標分析物的影響。質譜條件的優化主要是調整各個參數，使Hcy分子的母離子得到最佳的響應值。本研究使用ESI對Hcy進行Q1全掃描，獲得m/z 136.1的[M+H]+峰，內標的[M+H]+峰為m/z 140.1，以各自的分子離子峰為母離子，對離子源參數進行優化，使其各自的響應值達到最佳，然后對其各自的子離子進行全掃描，確定特征碎片離子，組成MRM離子通道。本研究Hcy定量檢測的MRM離子通道為m/z 136.1/90.0，內標檢測定量的通道為m/z 140.1/94.0。

參照CLSI C62-A文件和C50-A文件對建立的候選參考方法進行分析性能驗證。在建立方法時，所有的溶液配制和樣本移取均采用重量法；在進行標準曲線擬合時，以標準品定量離子峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，以標準品與內標的摩爾比為橫坐標，用最小二乘法進行直線擬合。結果顯示LC-MS/MS檢測總Hcy的線性范圍為0.5～200.0 μmol/L，定量限和檢測限分別為0.31和0.06 nmol/g。該方法的敏感性和線性范圍完全能夠滿足常規檢測的溯源要求。相對基質效應為2.04%，證明采用同位素內標能夠校正基質效應的影響。精密度評價結果顯示，本方法的批內、批間CV分別為＜2%和 ＜1%，3種濃度的加標樣本平均加標回收率分別為99.8%、100.2%、100.8%。Hcy的標準物質SRM 1955已經從NIST標準物質列表中刪除，本方法測定NIST SRM 1950標準物質的偏移＜1%，精密度和正確度符合參考測量程序的要求。LCMS/MS參考測量程序的定量分析方法一般采用包括法。標準溶液中被測組分的量與對應內標的量的比值控制在0.9和1.1，樣本中被測組分的量與內標的比值盡量控制在1.0左右。該方法能非常準確地測定待測組分的濃度，但操作較繁瑣，需要對待測樣本先測定一個初步濃度值，再采用包括法進行準確定量。最近，JCTLM公布了一種采用標準曲線法對25-羥基維生素D進行準確定量的參考測量程序[23]，其采用高、低濃度2條標準曲線，對高濃度樣本采用高濃度標準曲線進行定量，對低濃度樣本采用低濃度標準曲線進行定量，避免了二次測量，從而簡化了操作。本研究采用標準曲線法建立了血清Hcy的參考測量程序，其正確度和精密度符合參考測量程序的要求，表明標準曲線法也可以作為準確定量的方法。

綜上所述，本研究建立的基于LC-MS/MS的血清總Hcy候選參考測量程序具有操作簡便、特異性強、準確性好、運行穩定等特點，能夠用于總Hcy項目的量值溯源和標準化及常規檢測系統的正確度評價，在臨床檢驗中具有實用價值。