黃芩提取物逆轉細菌耐藥性及對16S rRNA甲基化酶基因表達影響的研究*

蔣文捷，梁雪梅（西南醫科大學附屬醫院老年科，四川瀘州646000）

隨著抗菌藥物的廣泛使用，細菌等病原體耐藥問題日趨嚴重，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐藥綠膿桿菌及大腸桿菌在內的多種引起醫院獲得性感染的病原體已經對β-內酰胺類、喹諾酮及大環內酯類等臨床常用抗菌藥物表現出耐藥現象[1-4]。因此，找到對耐藥菌株具有抑制作用的新型抗菌藥物，恢復或部分恢復抗菌藥物敏感的化合物逐漸成為研究熱點[5]。通過對清熱解毒類中藥提取物進行分析和研究，本研究發現黃芩提取物對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐藥銅綠假單胞菌和耐藥肺炎克雷伯菌的生長具有抑制作用，同時可以抑制16S rRNA甲基化基因的表達，提高耐藥菌對氟喹諾酮類抗菌藥物的敏感性。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2017年1月本院臨床患者體液及分泌物標本中培養鑒定的菌株90份，包括耐藥金黃色葡萄球菌、耐藥銅綠假單胞菌和耐藥肺炎克雷伯菌。黃芩提取物（購自四川世坤植物有限公司）主要成分包括黃芩苷、綠原酸等。

1.2 方法

1.2.1 供試品菌液的配制 將前期實驗鑒定得到的耐藥綠膿桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌及耐藥肺炎克雷伯菌接種到血平板（重慶龐通醫療器械有限公司）上培養，并根據菌落進行純化，于37℃條件下培養24 h。培養結束后將細菌從培養基中挑出，并與生理鹽水調節細菌濃度至0.5麥氏濁度。

1.2.2 供試品溶液的配制 精密稱取1.0 g黃芩提取物于試管內，加入1 mL生理鹽水震蕩使提取物充分溶解，制成黃芩提取物供試品溶液；精密稱取0.5 g環丙沙星、萬古霉素和氨曲南（浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠），加入1 mL生理鹽水并震蕩使溶解充分，分別制成環丙沙星、萬古霉素和亞胺培南供試品溶液，所得溶液經過0.22 μm微孔濾膜過濾備用。

1.2.3 藥物敏感度測定 藥物敏感試驗采用紙片擴散法（κ-B）法進行，具體步驟如下：高溫滅菌后的專用藥敏紙片浸于100 μL抗菌藥物溶液或黃芩提取物溶液中，吸收飽和取出晾干，并再次供試品溶液，直至吸收完全。細菌溶液均勻涂布在5只MH平板上，平板用無菌鑷子在平板的左右兩邊各放3片紙片，左邊的紙片上依次加入環丙沙星溶液、黃芩提取物溶液和環丙沙星+黃芩提取物溶液，右邊的紙片上依次加入生理鹽水、萬古霉素和氨曲南溶液（對照組）。于37.5℃條件下培養24 h后測定抑菌圈大小，并計算抑菌圈大小的平均值和標準差。

1.2.4 耐藥菌16S rRNA甲基化酶基因檢測 取耐藥菌菌落，分別接種于普通LB液體培養基、含環丙沙星500 mg/L的LB培養基、含黃芩提取物1000 mg/L的LB培養基，以及含黃芩提取物1000 mg/L+環丙沙星500 mg/L的LB培養基上，37℃條件下震蕩培養過夜。

耐藥菌16S rRNA甲基化酶基因表達采用反轉錄熒光定量聚合酶鏈反應方法進行檢測，armA和rmtB引物設計按照文獻[6-7]設計，其中 armA 引物：（P1）5′-AGG TTG TTT CCA TTT CTG AG-3′，（P2）5′-TCT CTT CCA TTC CCT TCT CC-3′；rmtB 引物：（P1）5′-ATG AAC ATC AAC GAT GCC C-3′，（P2）5′-CCT TCT GAT TGG CTT ATC CA-3′。采用25 μL反應體系對目標產物進行擴增，包括上下游引物各 1.25 μL、Taq 酶 12.5 μL、DNA模板3 μL和蒸餾水7 μL。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，具體條件如下：95℃條件下預變性3 min；92 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，進行 40 個循環。循環反應完成后，保持72℃5 min，反應結束后取10 μL擴增產物用含溴化乙啶的2%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，并掃描拍照。

1.2.5 熒光定量聚合酶鏈反應 采用25 μL反應體系對目標產物進行擴增，包括上、下游引物各1.25 μL、Taq 酶 12.5 μL、DNA 模板 3 μL，熒光染料 SYBR green 2.5 μL和蒸餾水4.5 μL。實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，具體條件如下：95℃條件下預變性3 min；92 ℃ 30 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，進行 40 個循環。循環反應完成后，保持72℃5 min，終止反應。設置5個標準滴度質粒作為陽性對照，濃度分別為1x103、5x103、1x104、5x104、1x105copies/μL。每個實驗重復 4 次，記錄平均值和標準偏差。

1.3 統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料以表示，2組間比較采用非配對t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 黃芩提取物、環丙沙星等對3種不同耐藥菌的抑菌圈直徑比較 黃芩提取物對耐藥金黃色葡萄球菌具有良好的抑制作用，其抑菌圈直徑較對照組及環丙沙星顯著提高，差異有統計學意義（t=15.57、13.47，P＜0.01）；黃芩提取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈的直徑略小于萬古霉素，差異無統計學意義（t=1.27，P＞0.05）。

黃芩提取物、環丙沙星對耐藥銅綠假單胞菌和耐藥肺炎克雷伯菌的抑制作用較差，其抑菌圈直徑與對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。而氨曲南對這2種耐藥菌具有良好的抑制作用，其抑菌圈直徑較對照組顯著增高，差異均有統計學意義（t=24.34、26.21，P＜0.01）。黃芩提取物+環丙沙星聯合可有效提高銅綠假單胞菌和耐藥肺炎克雷伯菌的抑菌圈直徑，差異均有統計學意義（t=21.57、20.40，P＜0.01）。另外，黃芩提取物+環丙沙星的治療效果與陽性對照藥物氨曲南相似，抑菌圈直徑比較，差異均無統計學意義（t=1.05、1.99，P＞0.05）。見表 1。

表1 黃芩提取物、環丙沙星等對3種不同耐藥菌的抑菌圈直徑比較（n=5，mm）

2.2 黃芩提取物、環丙沙星對耐藥菌16S rRNA甲基化酶基因表達的影響 在耐藥菌中，armA基因檢查結果呈現陽性，而rmtB基因檢查結果呈現陰性。黃芩提取物對3種不同耐藥菌株16S rRNA甲基化酶基因表達具有不同程度的抑制作用，其對耐藥金黃色葡萄球菌的作用十分明顯，而對耐藥肺炎克雷伯菌的作用稍弱；同時，黃芩提取物可以降低耐藥銅綠假單胞菌中armA的表達，但作用相對較弱。環丙沙星對3種耐藥菌armA基因表達的作用不明顯。另外，黃芩提取物+環丙沙星可以有效降低耐藥菌株armA的mRNA水平，作用優于單獨使用上述藥物。見圖1、2。

3 討 論

黃芩是臨床常用的中藥之一。研究表明，中藥黃芩可以通過多種不同機制控制耐藥菌引起的感染及炎性反應，如：黃芩中的主要成分黃芩苷對耐藥結核桿菌引起的金屬蛋白酶、白細胞介素-10等免疫抑制及血管生長因子分泌具有良好的抑制作用，從而控制耐藥結合桿菌的增殖[8]；黃芩提取物對淋球菌耐藥株的體外繁殖具有抑制作用，可以用于抗菌藥物敏感性較低的淋球菌感染及難治性淋病[9]；同時，黃芩提取物對多重耐藥鮑曼不動桿菌具有良好抑制作用，而且抗菌作用具有劑量依賴性，當黃芩提取物濃度超過40 mg/mL時可以完全抑制鮑曼不動桿菌耐藥株增殖[10]；另外，黃芩組成的復方制劑對耐藥超級細菌具有良好抑制作用，與β-內酰胺類抗菌藥物聯合后對超級細菌的抗菌作用明顯增強，遠高于抗菌藥物及黃芩苷單獨用藥的抗菌能力[11]。進一步的研究表明，黃芩增強抗菌藥物抗菌作用機制與耐藥性逆轉作用有關，黃芩等中藥提取物可以抑制廣譜β-內酰胺酶活性與表達，且抑制作用具有劑量依賴性[12]，并且對革蘭陽性菌的作用顯著高于革蘭陰性菌[13]。上述結果表明，黃芩及其提取物可能通過改變耐藥相關酶類的表達及活性，逆轉細菌耐藥，從而提高耐藥菌對抗菌藥物的敏感性。

圖1 黃芩提取物、環丙沙星對3種耐藥菌armA mRNA轉錄的影響

圖2 黃芩提取物、環丙沙星對3種耐藥菌armA mRNA循環閾值（Ct值）的影響

16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類抗菌藥物耐藥及超級細菌的形成密切相關，其不僅可以導致氨基糖苷類高水平耐藥，同時編碼于質粒上的酶基因可與β-內酰胺酶及氟喹諾酮耐藥因子一同轉移和表達[14-15]。16S rRNA甲基化基因包含armA、rmtB及rmtC 3部分，其中關于armA的研究最為深入。有研究表明，armA的表達與氨基糖苷類抗菌藥物的短期和長期耐藥、β-內酰類抗菌藥物耐藥，以及碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥有密切聯系[16-19]。也有研究表明，抗菌藥物類藥物可以通過16S rRNA途徑誘導β-內酰胺酶和氟喹諾酮耐藥基因的轉錄和翻譯[20]。因此，降低16S rRNA的轉錄和表達，可提高耐藥菌對抗菌藥物的敏感性，同時為逆轉致病菌耐藥提供新的治療方法。

本研究結果顯示，黃芩提取物本身抗菌作用有限，與抗菌藥物聯用可提高抗菌效果。黃芩提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于環丙沙星，差異有統計學意義（P＜0.05）；其抑菌圈直徑較萬古霉素稍小，差異無統計學意義（P＞0.05）。因此推測黃芩對耐藥金黃色葡萄球菌的作用可能直接通過抑制細菌生長和繁殖實現，armA基因表達量的減少可能與培養基中活菌數量的下降有關。

與金黃色葡萄球菌不同，黃芩對肺炎克雷伯菌及耐藥銅綠假單胞菌的生長繁殖的抑制效果較差，抑菌圈大小顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；同時，環丙沙星對于上述耐藥菌生長繁殖的抑制作用也十分有限。然而，黃芩提取物+環丙沙星可有效提高抑菌圈直徑，其抑菌圈的大小稍低于對照組，差異無統計學意義（P＞0.05）。提示黃芩提取物對armA的基因表達具有顯著的抑制作用。因此推測對于耐藥肺炎克雷伯菌和耐藥銅綠假單胞菌，黃芩提取物的主要作用為抑制16S rRNA甲基化酶基因的表達，從而抑制細菌藥物代謝及外排相關酶類的表達，從而提高對抗菌藥物的敏感性。對于上述細菌感染，聯合治療的效果優于藥物單獨治療。另一方面，聯合治療可以有效抑制耐藥細菌的生長繁殖。因此，接受聯合治療的耐藥菌armA基因的表達較單純接受黃芩提取物治療的細菌更低。

但是，黃芩提取物的作用機制尚需進一步研究，如：黃芩提取物的成分較為復雜，其中抑制細菌生長繁殖的有效成分及抑制armA基因轉錄的主要有效成分可能并不相同，因此，如何確定其中各種成分含量及不同組分的藥理作用依然需要進一步研究；同時，不同成分的相互作用可能影響有效成分的代謝及組織細胞分布。因此，黃芩提取物體外作用及作用機制與體內作用及作用機制是否相同，仍然需要進一步研究。

綜上所述，中藥黃芩提取物具有清熱解毒作用，可以有效抑制耐藥金黃色葡萄球菌的生長繁殖，同時抑制耐藥銅綠假單胞菌及耐藥肺炎克雷伯菌16S rRNA甲基化酶基因轉錄，提高耐藥菌對抗菌藥物的敏感性，從而提高抗菌藥物的抑菌作用。