槲皮素和原花青素對豚鼠白癜風模型黑素合成的影響

周夢圓 徐麗娟 譚 城 閔仲生

槲皮素學名為櫟精、槲皮黃素，是一種屬于黃酮類的天然有機化合物，由于其具有較強的抗氧化功效而在醫學上得到應用，主要存在于菟絲子以及桑寄生、紅花等中藥中，是主要活性成分之一。原花青素亦具有天然抗氧化物的成分，一般在銀杏以及葡萄中具有較高的含量。臨床中，上述藥物常用于白癜風的治療，而目前對于抗氧化作用治療白癜風的研究及應用較少。因此，結合槲皮素、原花青素的功效，我們設計了白癜風豚鼠模型的實驗，旨在分析通過其對治療前后皮損復色及對黑素顆粒、黑素小體的影響，探求其治療白癜風的發病機制，為白癜風的治療開辟途徑。

1 材料及動物

1.1 實驗試劑與動物 在90%的醫用乙醇中放入槲皮素或者原花青素母液(由南京澤朗生物科技有限公司提供)，配制成10 mg/mL的溶液，在-20℃的環境中進行保存。參照文獻[1，2]，臨用時調至為終極濃度為0.5%槲皮素，0.1%、0.3%原花青素。其中實驗中采用的8-甲氧補骨脂素酊劑由中國醫學科學院皮膚病醫院所提供。

為使實驗具有可觀察性[3]，選用健康褐色、雜色豚鼠共計38只(江蘇省中醫藥動物實驗中心提供，普通級)。其中，雌鼠18只，雄鼠20只，體重為300～500 g。首選把每只豚鼠背部進行脫毛處理，為方便觀察，脫毛面積約為4 cm×4 cm，每次均勻涂抹1 mL的5%過氧化氫溶液[4]，時間為每日2次，每次2～3分鐘，直至豚鼠毛色、皮膚變白。

1.2 分組 對豚鼠按體重劃分A～F組共6組，A組為標準對照組，外用90%乙醇對豚鼠背部進行處理；B組為空白對照組，采用蒸餾水；C組為陽性對照組，外用0.1%的8-MOP(每次涂藥后需進行日光照射，時間為10 min)；D組外用0.5%槲皮素酊劑；E組為外用0.1%原花青素酊劑；F組外用0.3%原花青素酊劑。每次涂藥1 mL，每天2次，連用40天后取皮損病理切片，觀察黑素合成情況。

2 實驗方法

2.1 皮膚顏色變化觀察 在試驗的過程中，設置固定的皮膚顏色觀察時間來查看每個試驗組的黑素沉著現象，2周一次進行拍照統計。色素復色的評分標準[5]：0分為蒼白或白斑或無變化；1分為淡褐色或色素面積恢復<50%；2分為中褐色或淺灰色或色素面積恢復>50%；3分為深褐色或黑素或色素基本恢復正常。若色素復色介于不同分數之間，則取平均值。

2.2 皮膚組織學變化 以HE染色觀察。

2.3 黑素合成情況 ①基于Fontana-Masson法[6]觀察黑色顆粒的變化情況：選取常規石蠟切片，放入配好的氫氧化氨銀溶液內，置于37℃暗處孵育，時間為2 h，然后采用標注的V、G液對比并進一步染色處理，染色2 min，最后以濃度為95%的乙醇、無水乙酸脫水，以二甲苯透明，以中性樹膠封片，觀察到的黑素顆粒為黑色；②采用電鏡觀察黑素小體分布及數目的變化。

2.4 統計學方法 本次實驗采用SPSS 17.0對實驗測試數據進行采集與分析，在處理的過程中，針對離散的數據建立秩和檢驗模型，針對正態分布的數據采用方差法進行分析，其次，每組數據之間采用Wilcoxon秩和檢驗，多組數據之間采用Friedman秩和檢驗的算法進行比較分析。

3 結果

在實驗期間，豚鼠背部無紅斑、鱗屑、破潰、水皰等不良的反應，38只豚鼠在實驗治療期間無死亡個例。

3.1 肉眼觀察色素積分 色素積分統計結果顯示如下：分別于治療2周、4周、40天的前后，比較C、D、F三組，色素積分存在顯著差異(秩和檢驗P<0.01)；C、D、F組之間的比較表明，三組色素積分為處理40天>4周>2周，隨著治療時間的延長，三種不同的處理方法對皮損復色的影響逐漸增大。治療2周、4周、40天前后，A、B、E組之間無統計學差異(表1)。

3.2 皮膚組織學變化 HE染色光鏡下觀察結果顯示，經過治療后的豚鼠表皮厚度與正常豚鼠表皮厚度沒有產生明顯差別，其中，采用A組與B組處理后的豚鼠表皮厚度較薄，C、D、E、F組處理后的豚鼠表皮厚度與正常豚鼠表皮厚度無明顯差異，其中D組處理后的豚鼠表皮厚度最接近正常豚鼠的表皮厚度。

經過實驗觀察，豚鼠實驗對照組的前后豚鼠細胞比較完整，在色素顏色方面，A、B組在治療后的基底層色素比C、D、F組有所增加，而且C、D、F組的實驗前后的色素也有所差異，實驗后色素都存在一定的增加。

表1 2周、4周、40天后的各組色素積分比較

注:*P<0.01，不同的處理天數比較差異有統計學意義

表2 Fontana-Masson法觀察黑色顆粒的變化情況

注：Fontana-Masson法結果顯示，與A、B組相比，其余4組黑素顆粒明顯增多，其中A、B組之間無明顯差異(均P<0.05)，D、F組明顯多于E組(均P<0.05)

3.3 黑素合成情況 在電鏡下觀察發現，在黑素小體的數量方面，0.1%原花青素組的黑素小體數量較少，且在觀察區域內黑素小體分布較分散；在實驗組內，槲皮素組的黑素小體的數量最多，然后是0.3%原花青素組，最后是0.1%原花青素組，可以看出原花青素的濃度大小對黑素小體的數量具有一定的影響(表2)。

4 討論

目前，白癜風的病因與黑素細胞凋亡的原因尚無定論，但在理論研究方面認為其發病機制主要來源于自身免疫、黑素細胞自毀、神經化學、微量元素、遺傳因素、微循環等方面。其中白癜風的發病機制與氧化應激密切相關。氧化應激是細胞過度產生或不充分清除活性氧分子的結果，導致機體氧化-抗氧化平衡受損，并可能導致蛋白質、脂質和核酸等不同生物大分子的非特異性損傷[7]。表皮內氧化應激作用于機體，具體表現在打破鈣穩態平衡、影響黑素的合成、過氧化氫的聚集以及遺傳等方面，從而導致白癜風的發生[8]。黑素細胞在通過外界紫外線的照射后，易產生大量的自由基而致細胞毒作用，在一定程度上加速黑素細胞的死亡。白癜風患者的外周血自由基代謝相關酶存在異常，故如何加速皮損內自由基清除是白癜風治療中主要難點之一。偽過氧化氫酶能夠恢復皮損處過氧化氫酶的活性，改善白癜風皮損的局部高氧化應激狀態，臨床中取得了一定的療效，但近年來也研究表明該藥物仍不甚理想。

植物藥及其中活性產物是天然、高效抗氧化劑。芹黃素[9，10]、黃芩素[11]等黃酮類化合物是天然的植物抗氧化劑，可減輕氧化應激所致黑素細胞損傷。槲皮素亦是一種黃酮類化合物，但目前關于其的相關研究甚少。原花青素藥效廣泛，對其研究和開發已有幾十年的歷史，但當前對其生理功能活性相關的分子結構、信號通路以及酶的認識仍尚不確切[12]。國內外對天然抗氧化劑的迫切要求，使得進一步研究槲皮素、原花青素勢在必行。

皮膚化學脫色法主要包括兩種，一為氫醒，二為過氧化氫，前者為酪氨酸酶抑制劑，抑制酪氨酸酶，影響黑素生成；后者為強效的氧化劑，漂白的主要成分為HO2-。龍子江等[13]使用5%過氧化氫對豚鼠脫色后發現：表皮基底層及棘層黑素、毛囊黑素明顯減少, 效果與用藥時間呈正比，說明過氧化氫具有模擬白癜風的作用。張蘭蘭等[14]運用二者對豚鼠脫色后，豚鼠細胞內的酪氨酸酶及黑素細胞、顆粒等都發生了變化，基底細胞數量減小的同時相應酶的活性也低于常態，因此該理論的研究具有模擬白癜風發病的作用。而諸多研究亦[15-17]表明，細胞損傷與細胞內的自由基的數量存在一定的聯系，白癜風患者表皮中過氧化氫的沉積致使氧化應激的狀態，直間接地損傷黑素細胞，而出現白斑。

經治療后的豚鼠表皮厚度與空白對照組沒有明顯變化，外用的中藥制劑對白癜風模型鼠皮膚進行復色，復色的區域未發生明顯的炎細胞浸潤現象，而許多外用西藥一般都含有糖皮質激素，有很大幾率會造成局部皮膚出現萎縮、變薄等不可逆的副作用。

實驗結果表明在治療白癜風時采用本實驗中的中藥治療方案，具有一定的效果，且通過電鏡觀察處理組的細胞，可以發現經過處理的皮膚區域內的毛囊周圍均觀察到黑素細胞的聚集，這也證實經過處理后皮膚出現復色效果，說明白癜風的復色過程主要是通過激活皮損內毛囊外毛根鞘存在的無功能性黑素細胞，激活后的黑素細胞進行分裂增殖并沿毛囊外毛根鞘上移進入表皮而完成。

實驗結果表明原花青素以及槲皮素均可以使棕色豚鼠皮膚黑素小體分布密度及數量增加，其中槲皮素組的實驗結果最為顯著，其次為0.3%原花青素。然而由于在電鏡下觀察到的樣本量很小，而且本次實驗中的實驗體數量有限，而且樣本具有一定的隨機性，實驗對比結果并不能代表全部情況，僅作為參考指標。