P62和Caspase-8在皮膚基底細胞癌組織中的表達

張 晶 王 鑫 王朋敏 郭 培 常軼可 劉 青 劉惠民 苗國英

皮膚基底細胞癌(basal cell carcinoma, BCC)在皮膚非黑素腫瘤中發病率占第一位，近年來，皮膚腫瘤發病率呈現逐漸升高的趨勢。

Caspase-8是一種天門冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，幾乎可以引發所有凋亡級聯反應下游的凋亡相關因子，誘發凋亡，是Caspase家族中重要的凋亡啟動因子。P62/SQSTM1是一種多功能泛素化結合的接頭蛋白，由P62/SQSTM1基因所編碼，參與組成細胞內多種蛋白質復合物，廣泛參與細胞內的自噬、凋亡等多種病理生理過程，常被稱為自噬蛋白。

細胞惡性增殖以及免疫逃逸是造成腫瘤病情進展的關鍵因素，而在這一過程中細胞凋亡調控發揮了至關重要的作用。研究發現，P62在人類多種惡性腫瘤中存在異常增多，其在非乳腺癌、小細胞肺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞中表達量明顯高于正常細胞[1]。Zeng等研究發現腦部膠質母細胞瘤中Caspase-8和P62共同參與細胞凋亡過程，其中P62主要通過作用于Caspase-8來調節Caspase介導的級聯反應，從而影響細胞凋亡過程[5]。國外有研究表明，P62通過Cullin3作用于死亡誘導信號復合體(death-induring signaling complex，DISC)促進聚泛素化，激活細胞內Caspase-8，從而達到影響機體Caspase-8的細胞凋亡的目的[2]。Caspase-8和P62分別為凋亡蛋白和自噬相關蛋白，在BCC中的表達及與凋亡和自噬的關系尚無相關報道。

本實驗擬采用免疫組織化學染色法，試圖通過檢測凋亡相關蛋白Caspase-8和自噬相關蛋白P62在皮膚BCC的表達，探究兩者在BCC的發生、發展過程中的作用及意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2016年3月至2017年5月河北工程大學附屬醫院皮膚科BCC患者的石蠟組織標本共45例作為實驗組，其中，男19例，女26例。年齡17～83歲，平均(61.9±13.9)歲；所有蠟塊均經兩位資深病理醫生復查并明確診斷，重復檢查的病例僅將首次資料納入實驗。另選取本院整形外科手術切除的正常皮膚組織標本10例，制成石蠟標本作為對照研究，其中，男4例，女6例。年齡40～74歲，平均(59.4±13)歲。實驗組和對照組選取的標本均位于頭面部，無其他皮膚病或系統性疾病，術前無局部治療史。

1.2 主要試劑兔抗人P62單克隆抗體(Abcam公司)工作濃度為1∶500；兔抗人Caspase-8單克隆抗體(Abcam公司) 工作濃度為1∶200；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒和PBS粉(pH值7.2～7.4)均購自北京中杉金橋生物技術有限公司；檸檬酸鈉抗原修復液(50×)購自上海歌凡生物科技有限公司。

1.3 實驗方法 組織切片的制備將石蠟組織標本4 μm連續切片，采用免疫組化聚合物酶標二抗法，行抗原修復液水浴修復抗原，具體步驟參照試劑盒說明書進行，DAB顯色，蘇木精復染。實驗分組：正常皮膚組、BCC組。正常皮膚為對照組。采用0.01 mol/L的PBS(pH值7.4)緩沖液代替一抗作為陰性對照， P62和Caspase-8分別選用口腔鱗癌和扁桃體組織作為陽性對照。

1.4 結果判定 由至少2名病理科診斷醫師對免疫組織化學染色切片進行評估。在顯微鏡下觀察BCC細胞和正常表皮著色情況，結果評估根據Fromowitz[3]的綜合計分法進行，每張陽性切片隨機選取10個高倍視野(400×)。按陽性細胞的百分比分級：5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>76%為4分；并按染色強度計分：無染色為0分，淺染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分。兩項結果計分相加計算總得分，可分為四個等級：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性(++)，6-7分為強陽性(+++)，計算陽性表達率時，總得分≥2判定為陽性。

1.5 統計學方法 使用SPSS 22.0統計軟件對實驗結果進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差表示，等級資料采用秩和檢驗、Spearman秩相關分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Caspase-8在BCC和正常皮膚中的表達 Caspase-8在細胞中的表達主要定位于胞質。正常皮膚組織中有9例陽性表達，多呈中度陽性； 20例BCC中Caspase-8呈陽性表達，且染色強度多為弱陽性和中度陽性。BCC中Caspase-8陽性表達低與正常皮膚組織有統計學差異(表1，圖1)。

表1 Caspase-8在BCC和正常皮膚中的表達

注 ：與正常皮膚相比，Z=-2.711，P<0.05

2.2 P62在BCC和正常皮膚中的表達P62在細胞中的表達多數位于細胞質，部分位于細胞核。39例BCC中P62呈陽性表達，染色自弱陽性至強陽性，以中度陽性染色為主；正常皮膚組織中有4例為陽性表達，BCC中P62的陽性表達高于正常皮膚組織(圖1，表2)，差異有統計學意義。

表2 P62在BCC和正常皮膚中的表達

注：與正常皮膚相比，Z=-2.951，P<0.05

2.3 Caspase-8與P62的相關性分析 經Spearman秩相關分析表明，BCC中Caspase-8的陽性表達水平和P62的陽性表達水平呈負相關(表3)。

表3 Caspase-8和P62的相關性

注：秩相關性分析，r=-0.322，P<0.05

3 討論

近年來，研究表明腫瘤細胞凋亡的機制以細胞外途徑為主，其中又以Caspase家族介導的級聯反應為主，凋亡的所有信號通路均需激活Caspase酶系這一終極步驟，誘導激活下游的酶促級聯反應，引發細胞凋亡。Athar等[4]研究表明，通過調控Fas的表達和激活Caspase-8而誘發細胞凋亡，可阻止由于紫外線誘導的BCC的發生。

a：正常皮膚組織中Caspase-8的表達；b：BCC中Caspase-8的表達；c：陽性對照中Caspase-8的表達；d：陰性對照中Caspase-8的表達；e：正常皮膚組織中P62的表達；f：BCC中P62的表達；g：陽性對照中P62的表達；h：陰性對照中P62的表達

P62聚集物是細胞內的信號中心，激活TRAF6-NF-KB途徑，可能推動Caspase-8相關復合物和下游Caspase途徑凋亡效應器的形成。P62在多種腫瘤中超表達，并與腫瘤易發生轉移有關。Caspase-8和P62分別為凋亡蛋白和自噬相關蛋白，在BCC中的表達及與凋亡和自噬的關系尚無相關報道。曾有研究發現腫瘤中二者之間存在關系，在膠質母細胞瘤的U87MG細胞中，經給予蛋白抑制劑MG132，抑制細胞自噬活性，當P62蛋白表達升高，Caspase-8隨之被激活，說明在Caspase-8的活化過程中，P62起到很關鍵的作用[5]。Xuel等[6]使生長因子缺乏或給予阿糖胞苷處理交感神經元時，細胞的自噬活性發生明顯提高，并出現了細胞凋亡現象；使用自噬抑制劑處理后，神經元細胞內的反應停止在凋亡過程中的活化階段而不再繼續進行，提示凋亡的執行依賴于自噬過程。

本研究顯示在BCC組織中，Caspase-8在癌組織表達明顯低于正常上皮組織，提示BCC組織中存在凋亡異常；而P62在BCC組織中的陽性率明顯高于正常對照，提示Caspase-8和P62的可能與BCC的發生、發展相關。

為進一步探討P62在BCC發生過程中的作用，我們對Caspase-8和P62的表達相關性做出了分析。通過統計學分析，BCC中Caspase-8和P62的表達呈現負相關，推測P62可能通過作用于Caspase-8，通過影響其凋亡的泛素化過程，從而影響凋亡下游的級聯反應，進而影響機體腫瘤的凋亡過程。有研究表明，CDK1誘導的P62磷酸化缺陷會增加腫瘤發生的概率，并增強細胞增殖。P62通過參與Ras、MAPK、NF-kB等信號通路的調節，促進腫瘤遷移和增殖。

然而至今為止，在皮膚BCC中的P62對凋亡調節機制的研究資料極為有限，因此對P62在皮膚腫瘤中的作用機制可做進一步研究。