兒童特應性皮炎患者腸道菌群中益生菌的構成比研究

羅瑞靜 王英杰 劉 杰 彭 勇 武宗琴 姜珠倩 李 淑 柴維漢

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是皮膚科常見病，多發病，近年來由于其發病率在世界范圍內逐年升高，給家庭和社會帶來嚴重經濟負擔[1]。該病起始于嬰幼兒期，歷經兒童期，最終發展成為成人特應性皮炎，嚴重影響患者生活質量。其發病機制目前尚未完全闡明，已有研究表明腸道菌群中益生菌數量的減少參與該病的發生及發展，且應用益生菌治療該病確有良效[2，3]。因此，積極闡明其發病機制，有利于臨床治療，本實驗即探討兒童特應性皮炎患者腸道菌群中益生菌的變化情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 符合納入標準的35例6～12歲特應性皮炎患者均為2015年4月至2017年4月在上海市嘉定區中醫醫院皮膚科門診就診患者，另外27名6～12歲健康對照組兒童來自上海市嘉定區城中路小學和普通小學。本研究獲得醫院醫學倫理委員會的批準，研究對象及家長或監護人均知情同意。

1.2 納入標準 AD組納入標準：(1)符合Williams[4]診斷AD標準者；(2)6～12歲兒童；(3)無其他皮膚疾病；(4)無心、肝、腎等各系統嚴重異常；(5)無精神疾病、殘疾、智力障礙；(6)近2個月未內服過糖皮質激素或近2周內未外用過此類藥品；(7)近2周未患腹瀉等腸道疾病及近2周未服用含益生菌等微生物制劑；(8)近2周沒有使用抗生素。Normal組納入標準：AD組納入標準(1)除外，還需無過敏性鼻炎、哮喘等過敏性疾病史。

1.3 樣本采集 將糞便放于糞便收集盒中，要求避免尿液、灰塵等污染，選取無污染的部分，糞便標本量大于1 g。標本采集后標記姓名，并進行編號，標記后存儲于-20℃冰箱，干冰運送至上海美吉生物醫藥科技有限公司進行檢測。

1.4 樣本檢測

1.4.1 實驗試劑及儀器

1.4.1.1 實驗試劑 見表1

1.4.1.2 實驗儀器 見表2

表1 實驗所用試劑、型號、公司及國家

表2 實驗所用儀器、型號、公司及國家

1.4.2 DNA提取及PCR擴增 根據E.Z.N.A.? soil試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.)說明書進行總DNA抽提，DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量；用338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)引物對V3-V4可變區進行PCR擴增。

1.4.3 Illumina MiSeq測序及分析 應用上海美吉生物醫藥科技有限公司Illumina MiSeq測序平臺對研究對象治療前后糞便細菌的16SrRNA基因V3～V4區進行高通量測序及分析。

1.5 統計學方法 生物學統計及分析由上海美吉生物醫藥科技有限公司i-sanger平臺提供。

2 結果

2.1 樣本信息統計 將測序所得原始序列去雜處理后，62個樣本共獲得 2269944條優化序列可供后續分析，平均長度435.96 bp，其中99.95%序列長度集中在400～500 bp，基本覆蓋了16SrDNA V3+V4雙高變區的全長。對所有樣本進行抽平后物種篩選，共獲得Domain:1個；Kingdom:1個；Phylum:16個；Class:30個；Order:48個；Family:82個；Genus:230個；Species:427個；OTU:569個。

2.2 群落組成分析(Community composition analysis) 在不同分類學水平上統計各樣本的物種豐度，通過(圖1)來直觀研究群落組成。

通過AD組與N組樣本微生物屬水平群落組成分析可以看出：Heatmap圖展示的10個屬，來自于4個菌門，結果表明AD組樣本中物種豐度總體低于N組樣本。

注：熱圖下側和右側分別為樣本名稱和OTU編號(或者物種名稱)，如果進行了聚類分析左側和上側分別為物種聚類樹和樣本聚類樹。熱圖中顏色的深淺分別代表OTU(或者物種)豐度的高低。

2.3 物種差異分析 組間差異顯著性檢驗根據得到的群落豐度數據，運用統計學方法可以檢測不同組(樣本)微生物群落中表現出的豐富度差異的物種，進行假設性檢驗，評估觀察到的差異的顯著性。本實驗選擇屬、種水平雙歧桿菌與乳酸桿菌已知物種進行秩和檢驗分析。

通過比較可以看出：在屬水平，AD組患者雙歧桿菌屬物種豐度較N組升高，而乳酸桿菌屬物種豐度較N組降低(表3)；在種水平，AD組患者雙歧桿菌屬下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物種豐度較N組升高，而Bifidobacterium_breve物種豐度降低，差異均無統計學意義(P>0.05)。AD組乳酸桿菌屬下Lactobacillus_salivarius 物種豐度較N組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物種豐度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物種豐度升高差異有統計學意義(P<0.05)(表4)。

表3 AD組與N組益生菌在屬水平差異比較一覽表

注：P>0.05

表4 AD組與N組益生菌在種水平差異比較一覽表

注：*P<0.05

3 討論

特應性皮炎是一種慢性、瘙癢性、過敏性、炎癥性皮膚病，其發病機制復雜，已有研究證實，免疫異常是其發病的關鍵環節，其中Th1/Th2分化失衡引起細胞因子分泌異常在AD發生發展中發揮重要作用[5]。但其具體發病機制并未完全闡明，近來，益生菌的缺乏參與特應性皮炎的發生及發展正逐步為大家所認識[6]，并成為研究熱點。

腸道微生態系統是人體微生態系統的重要組成部分，腸道微生物與機體相互作用，保持動態平衡，共同維護機體生理功能正常發揮，當這種動態平衡被打破，影響到機體生理功能正常發揮時，疾病就會發生[7]。其中益生菌是腸道菌群的重要組成部分之一,世界衛生組織(WHO)定義“益生菌為活的微生物，補充適當的數量對宿主產生益處”，臨床上廣泛使用的益生菌主要是雙歧桿菌、乳酸桿菌[8，9]。本次實驗即通過高通量測序技術通過檢測兩組患者糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌兩屬下種的變化情況，來探討AD患者腸道菌群中益生菌的變化情況。

雖然益生菌干預/治療AD的研究相對較多，對緩解AD病情有一定幫助，但Meta分析顯示，二者之間并無明顯差異，因此也有待進一步確定[10]。但是腸道益生菌通過調節機體免疫系統參與以及治療過敏性疾病的研究已相對較為明確[6]。目前而言尚缺乏特應性皮炎患者與正常人腸道菌群或益生菌差異的直接比對研究。本研究通過高通量測序檢測比較發現：在屬水平，AD組患者雙歧桿菌屬物種豐度較N組升高，而乳酸桿菌屬物種豐度較N組降低；在種水平，AD組患者雙歧桿菌屬下Bifidobacterium_pseudocatenulatum_DSM_20438__JCM_1200__LMG_10505、unclassified_g__Bifidobacterium、Bifidobacterium_adolescentis、Bifidobacterium_animalis物種豐度較N組升高，而Bifidobacterium_breve物種豐度降低，差異均無統計學意義(P>0.05)。AD組乳酸桿菌屬下Lactobacillus_salivarius物種豐度較N組降低，但差異無統計學意義(P>0.05)，而unclassified_g__Lactobacillus、Lactobacillus_plantarum_subsp._plantarum物種豐度升高，且unclassified_g__Lactobacillus物種豐度升高差異有統計學意義(P<0.05)。

Munyaka等[11]通過比較患有特應性疾病和非特應性疾病嬰兒的腸道菌群，發現二者具有顯著差異,非特應性疾病嬰兒腸道中含有更多的雙歧桿菌和乳酸桿菌，而特應性疾病嬰兒腸道中卻含有較多的梭狀芽孢桿菌。本研究并未發現AD患者腸道益生菌較正常人明顯降低，雖然存在一定差異，但該差異與已有研究報道并不完全一致，可能與實驗設計中研究對象、病程、檢測方法等因素相關，今后應深入研究。