長(zhǎng)尖葉薔薇基于rDNA FISH的核型分析

張 婷，蹇洪英，莫錫君，邱顯欽，楊 靜，唐開(kāi)學(xué)，王其剛*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所/云南省花卉育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650200；2.中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所，云南 昆明 650201)

【研究意義】長(zhǎng)尖葉薔薇(RosalongicuspisBertol.)為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(RosaL.)合柱組(SectionSynstylaeCD.)攀援灌木，廣泛分布于西南三省，印度北部也有分布，植株高大、葉片光亮革質(zhì)[1]，具有較好的抗寒性[2-3]及對(duì)白粉病菌免疫[4]等優(yōu)良性狀。云南地區(qū)的長(zhǎng)尖葉薔薇居群間存在中度遺傳分化，居群遺傳多樣性較高[5]，是現(xiàn)代月季遺傳育種的優(yōu)良種質(zhì)資源。【前人研究進(jìn)展】核型分析是作物育種的基礎(chǔ)。Akasaka等[6-7]和張婷等[8]發(fā)現(xiàn)薔薇屬植物中存在異形同源染色體，而以往的常規(guī)核型分析中均未有報(bào)道[9-18]，因此，以前的常規(guī)核型分析可能對(duì)染色體有誤配。染色體熒光原位雜交(FISH)技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)周期短、靈敏度高、分辨率高、直觀可見(jiàn)等優(yōu)點(diǎn)，可通過(guò)rDNA在染色體上的定位，清楚地識(shí)別形態(tài)相近的染色體[19]。由于薔薇屬植物的染色體為小染色體[6-7]，平均長(zhǎng)度僅有2.81 μm[20]，利用基于rDNA FISH對(duì)其進(jìn)行核型分析更為準(zhǔn)確可靠。【本研究切入點(diǎn)】利用45S和5S rDNA為探針，對(duì)長(zhǎng)尖葉薔薇進(jìn)行染色體熒光原位雜交研究，在對(duì)rDNA進(jìn)行精確物理定位的同時(shí)獲得長(zhǎng)尖葉薔薇更為準(zhǔn)確的染色體核型數(shù)據(jù)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究可為其在薔薇屬植物特別是現(xiàn)代月季的種質(zhì)創(chuàng)新和遺傳改良中提供分子細(xì)胞遺傳學(xué)背景資料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的長(zhǎng)尖葉薔薇來(lái)自云南省彌勒市，以嫁接苗的方式保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所月季種質(zhì)資源圃中。

1.2 方法

1.2.1 探針標(biāo)記 5S rDNA以PCR方法獲得，上游引物：5’-GAGTAGTACTAGGATGGGTGACC-3’；下游引物:5’-CTCTCGCCCA ARCWCGCTTAACT -3’，由云南精賽頓生物科技有限公司合成，PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min，94 ℃ 20 S，55 ℃ 30 S，72 ℃ 40 S，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 7 min。45S rDNA和5S rDNA按張婷等[8]的方法標(biāo)記。

1.2.2 染色體制片、原位雜交、圖像檢測(cè)及分析 染色體片子參考田敏等[21]的方法進(jìn)行。原位雜交方法：a.雜交前的準(zhǔn)備：選取染色體分散良好的制片；加100 μl 10～50 μg/mL的胃蛋白酶溶液于制片上，蓋上封口膜，37 ℃孵育20～60 min；用ddH2O沖洗干凈，用2×SSC洗2次每次5 min；將玻片于60 ℃烘箱中干燥2～3 h，放置至室溫。配置雜交液30 μl [100 %去離子甲酰氨(Formamide)20 μl，50 %硫酸葡聚糖(DS)5 μl，20×SSC 2 μl，10 % SDS 1 μl，2種探針各1 μl]。混勻后于97 ℃變性10 min，迅速轉(zhuǎn)入冰中0 ℃以下至雜交(10 min以上)。b.染色體變性：每個(gè)玻片加70 %去離子甲酰氨100 μl，蓋上封口膜后于75 ℃變性3 min；70 %、95 %、100 %乙醇于-20 ℃下脫水，每級(jí)5 min；迅速甩干后進(jìn)行雜交。c.雜交：將雜交液滴于玻片上，加封口膜蓋片，轉(zhuǎn)入50 ℃水浴中孵育15～20 h。d.洗脫和信號(hào)檢測(cè)：雜交制片用2×SSC漂去蓋片；0.1 %SDS(2×SSC)37 ℃3次，每級(jí)5 min；0.1 %SDS(0.2×SSC)37 ℃ 3次，每級(jí)5 min；2×SSC室溫下沖洗2次，甩干制片；加50 μl/片現(xiàn)配的5 %BSA，蓋上封口膜，37 ℃封阻30 min。以下步驟避光：甩干封阻液，加60 μl抗體混合液 [Avidin-FITC(10 mg/mL)、Anti-digoxigenin-rhodamine(10 mg/mL)各30 μl]，蓋上封口膜，37 ℃孵育1 h；1×PBS漂去蓋片，1×PBS/Teween20中，37 ℃ 3次，每級(jí)5 min；加含有100 mg/mL DAPI的抗熒光衰減劑，蓋上干凈的蓋玻片。e.雜交圖像在Zeiss熒光顯微鏡(Axiophot 2)下觀察并獲取，用Zeiss及Photoshop軟件對(duì)圖像分析、處理。選取分散良好、形態(tài)清晰、雜交信號(hào)清晰的5個(gè)體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行核型分析，核型分析按照李懋學(xué)和陳瑞陽(yáng)[22]的標(biāo)準(zhǔn)，核型類型根據(jù)Stebbin[23]的分類標(biāo)準(zhǔn)劃分，核型數(shù)據(jù)用Excel分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 長(zhǎng)尖葉薔薇rDNA FISH核型分析

長(zhǎng)尖葉薔薇基于rDNA FISH的核型公式為2n=2x=14=10m+4sm，核型為2A型，染色體組由中長(zhǎng)染色體(M1)和中短染色體(M2)組成(表1)。除4號(hào)和5號(hào)染色體為亞中部著絲點(diǎn)染色體(sm)外，其余均為中部著絲點(diǎn)染色體(m)，其中5號(hào)染色體是1對(duì)相對(duì)長(zhǎng)度差異很大的異形同源染色體，二者的相對(duì)長(zhǎng)度相差(2.03±0.14)%，其中較長(zhǎng)染色體為中長(zhǎng)染色體(M2)，相對(duì)長(zhǎng)度為(7.96±0.33)%，臂比值為2.22±0.12，較短染色體為中短染色體(M1)，相對(duì)長(zhǎng)度為(5.93±0.20)%，臂比值為1.85±0.10；4號(hào)的2條染色體的相對(duì)長(zhǎng)度也有較大差異，它們的相對(duì)長(zhǎng)度相差(0.64±0.01)%，2條染色體都為中短染色體(M1)，其中較長(zhǎng)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為(7.11±0.14)%，臂比值為1.81±0.10，較短染色體的相對(duì)長(zhǎng)度為(6.47±0.13)%，臂比值為1.90±0.11(表2)。

表1 長(zhǎng)尖葉薔薇體細(xì)胞中期染色體基于rDNA FISH的核型參數(shù)及rDNA位置

表2長(zhǎng)尖葉薔薇4號(hào)、5號(hào)染色體基于rDNAFISH的核型參數(shù)及rDNA信號(hào)強(qiáng)弱

Table 2 Karyotype parameters of the 4th and 5th pair of chromosomes ofR.longicuspisbased on FISH with 45S and 5S rDNA as probes and the strength of rDNA signals

染色體名稱Chromosome name45S rDNA信號(hào)強(qiáng)度 45S rDNA signal strength5S rDNA信號(hào)強(qiáng)度 5S rDNA signal strength相對(duì)長(zhǎng)度(%)Relative length臂比值A(chǔ)rm ratio著絲點(diǎn)類型Centromere type染色體相對(duì)長(zhǎng)度組成 Constitution of relative length兩條同源染色體相對(duì)長(zhǎng)度差值The relative length difference between the heteromorphic homologous chromosomes4號(hào)較長(zhǎng)同源染色體2+7.11±0.141.81±0.10smM10.64±0.014號(hào)較短同源染色體10+6.47±0.131.90±0.11smM15號(hào)較長(zhǎng)同源染色體3+2+7.96±0.332.22±0.12smM22.03±0.145號(hào)較短同源染色體2++5.93±0.201.85±0.10smM1

2.2 45S rDNA和5S rDNA在長(zhǎng)尖葉薔薇染色體中的精確定位

45S和5S rDNA在長(zhǎng)尖葉薔薇上分別檢出1對(duì)和2對(duì)位點(diǎn)(圖1)。45S rDNA有1對(duì)雜交位點(diǎn)，位于5號(hào)染色體整條短臂上(5S)，信號(hào)明顯且2個(gè)信號(hào)強(qiáng)弱差異不大。5S rDNA有4個(gè)雜交位點(diǎn)，其中一對(duì)位點(diǎn)位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂(4L)的近著絲粒處，2個(gè)位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度差異很大，位于較短染色體上的信號(hào)極強(qiáng)、另一個(gè)很弱；另一對(duì)位點(diǎn)位于5號(hào)染色體長(zhǎng)臂(5L)上部，信號(hào)明顯，2個(gè)位點(diǎn)的雜交信號(hào)均較弱，差異不大。

2.3 合柱組4個(gè)野生種的rDNA FISH差異

已有的研究表明，薔薇屬二倍體野生種中5S rDNA位點(diǎn)按是否與45S rDNA有共線性分為2種：只有1對(duì)位點(diǎn)的5S rDNA與45S rDNA沒(méi)有共線性，即：與45S rDNA不在同1對(duì)染色體上；有1對(duì)以上5S rDNA位點(diǎn)的，其中1對(duì)與45S rDNA位于同一染色體上，其余位點(diǎn)位于其它染色體上[6-8,11]，長(zhǎng)尖葉薔薇屬于后者。已有的研究顯示，與長(zhǎng)尖葉薔薇同屬于合柱組(SectionSynstylae)的野薔薇(R.multifloraThunb.，2n=2x=14)、光葉薔薇(R.wichurianaCrép.，2n=2x=14)及川滇薔薇(R.soulieanaCrép.，2n=2x=14)的45S rDNA位點(diǎn)數(shù)均與長(zhǎng)尖葉薔薇相同，為1對(duì)(2個(gè))，5S rDNA除野薔薇為3個(gè)外，其余為2對(duì)(4個(gè))，分布模式為后者(表3)[6,8]。

a, a’：45S rDNA(綠)和5S rDNA(紅)與DAPI 復(fù)染的染色體(藍(lán))的合成圖；b：長(zhǎng)尖葉薔薇有絲分裂中期染色體；c：45S rDNA 雜交信號(hào)(綠)；d：5S rDNA 雜交信號(hào)(紅)a, a’: A merged image of the metaphase chromosomes and the FISH signals. 45S rDNA (green), 5S rDNA (red), DAPI (blue); b: Metaphase chromosomes; c: FISH signals of 45S rDNA (green); d: FISH signals of 5S rDNA (red)圖1 長(zhǎng)尖葉薔薇中期染色體rDNA FISH及核型Fig.1 FISH localization of 45S rDNA and 5S rDNA on metaphase chromosomes of R. longicuspis and homologous pairing of chromosomes

45S rDNA位點(diǎn)總數(shù)/位置45S rDNA loci number/site5S rDNA位點(diǎn)總數(shù)/位置(個(gè)數(shù))5S rDNA loci number/site45S rDNA 強(qiáng)弱差異45S rDNA signal intensity5S rDNA 強(qiáng)弱差異5S rDNA signal intensity野薔薇 (R. multiflora)[6]2/7S3/3L (1), 7S (2)--光葉薔薇 (R. wichurana)[6]2/7S4/5 L (2), 7S (2)--川滇薔薇 (R. soulieana)[8]2/7S4/4L (2), 7L (2)2個(gè)信號(hào)略有差異4個(gè)信號(hào)較強(qiáng),略有差異長(zhǎng)尖葉薔薇 (R. longicuspis)2/5S4/4L (2), 5L (2)2個(gè)信號(hào)略有差異位于4L的信號(hào)極強(qiáng),其他3個(gè)信號(hào)較弱。

光葉薔薇與45S rDNA有共線性的5S rDNA位于此對(duì)染色體的短臂上[6]，川滇薔薇[8]及長(zhǎng)尖葉薔薇的這對(duì)5S rDNA則位于此對(duì)染色體的長(zhǎng)臂上。川滇薔薇與45S rDNA無(wú)共線性的1對(duì)5S rDNA位于4號(hào)染色體，這對(duì)5S rDNA的信號(hào)強(qiáng)度雖有差異但不顯著；長(zhǎng)尖葉薔薇的這對(duì)5S rDNA位于5號(hào)染色體，二者的信號(hào)強(qiáng)度差異極其顯著。由rDNA的分布和雜交位點(diǎn)的特征可將這4種親緣關(guān)系很近的物種在染色體水平上區(qū)分開(kāi)(表3)。這4個(gè)種的5S rDNA有類似的分布模式，但又有各自不同于其它種的特征，可見(jiàn)rDNA FISH是進(jìn)行細(xì)胞分子遺傳學(xué)研究的有力工具。

3 討 論

Jian等經(jīng)常規(guī)核型分析獲得的長(zhǎng)尖葉薔薇的核型與本研究的結(jié)果不同：核型公式為2n=2x=14=12m+2sm，染色體組成中多了長(zhǎng)染色體(L)，其中，僅第4對(duì)為亞中部著絲粒染色體(sm)，屬于中短染色體(M1)，臂比值為2.77，此對(duì)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度之和為13.65，平均每條染色體為6.825，其余均為中部著絲粒染色體(m)[9-10]。經(jīng)rDNA FISH核型分析的第4對(duì)和第5對(duì)染色體的兩條相對(duì)較長(zhǎng)染色體的相對(duì)長(zhǎng)度較接近，另外兩條較短染色體的相對(duì)長(zhǎng)度也較接近，經(jīng)常規(guī)核型分析時(shí)易被各配為1對(duì)，Jian等分析的第4對(duì)sm染色體很可能是由前者組成；另外，少了一對(duì)sm染色體可能跟材料預(yù)處理等有關(guān)。

已有的研究表明，薔薇屬植物的45S rDNA幾乎都定位在1對(duì)異形同源sm染色體的短臂上[6-8,11]，5S rDNA所定位的染色體表現(xiàn)了更豐富的多樣性，在種類和種間均有差異，有的是異形同源sm染色體，有的不是異形同源染色體，這在以往的常規(guī)核型分析研究中未見(jiàn)報(bào)道[9-18]。由于異形同源染色體存在顯著的長(zhǎng)度差異，常規(guī)核型分析時(shí)不會(huì)將它們配為一對(duì)。因此，基于rDNA FISH的核型分析結(jié)果更準(zhǔn)確，對(duì)薔薇屬植物的遺傳育種更具指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

通過(guò)熒光原位雜交技術(shù)對(duì)長(zhǎng)尖葉薔薇的45S rDNA與5S rDNA在體細(xì)胞中期染色體上進(jìn)行FISH定位，可準(zhǔn)確識(shí)別其染色體組中的同源染色體，并由rDNA位點(diǎn)體現(xiàn)它在染色體水平上的特征，為染色體識(shí)別提供明確的標(biāo)記，也為長(zhǎng)尖葉薔薇用于現(xiàn)代月季的遺傳改良提供初步的分子細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。