TNF—α椎間盤注射對軟骨終板β—catenin與Adamts—5表達影響

魏平洋　　夏炳江　　沈欽榮　　胡松峰　　侯明生

[摘要] 目的 探討TNF-α椎間盤注射對大鼠軟骨終板β-catenin與Adamts-5蛋白表達的影響與意義。 方法 取SPF級12周齡SD大鼠30只，隨機分成空白對照組（A組）、假手術組（B組）、TNF-α椎間盤注射組（C組），每組10只（n=10）。C組大鼠在X線透視下穿刺椎間盤并注射TNF-α 25 μL（10 ng/μL），B組大鼠椎間盤穿刺成功后注射生理鹽水25 μL，A組大鼠椎間盤不做任何干預。術后4周采用組織病理學觀察軟骨終板退變情況，并采用Western-Blot檢測軟骨終板β-catenin與Adamts-5蛋白表達。 結(jié)果 HE染色顯示C組大鼠椎間盤軟骨終板出現(xiàn)明顯退行性改變。Western-Blot檢測顯示C組大鼠椎間盤軟骨終板β-catenin與Adamts-5表達均顯著上調(diào)，與A組及B組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 結(jié)論 TNF-α椎間盤注射可誘發(fā)椎間盤軟骨終板退變，同時上調(diào)軟骨終板β-catenin及Adamts-5表達，提示TNF-α上調(diào)β-catenin及Adamts-5表達在軟骨終板退變中可能發(fā)揮了重要作用。

[關鍵詞] TNF-α；軟骨終板；β-catenin；Adamts-5

[中圖分類號] R681.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）17-0024-04

Effect of intervertebral disc injection of TNF-α on the expression of β-catenin and Adamts-5 in cartilage endplate

WEI Pingyang1 XIA Bingjiang1，2 SHEN Qinrong1 HU Songfeng1 HOU Mingsheng1

1.Department of Orthopedics， Shaoxing Hospital of TCM， Shaoxing 312000， China； 2.Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To investigate the effect and significance of intervertebral disc injection of TNF-α on the expression of β-catenin and Adamts-5 protein in rat cartilage endplate. Methods 30 Sprague-Dawley（SD） rats of SPF grade were randomly divided into blank control group（group A）， sham operation group（group B） and TNF-α intervertebral disc injection group（group C）， with 10 rats in each group. The rats in group C were given intervertebral disc puncture under X-ray and injected with TNF-α of 25 μL（10 ng/μL）. Rats in group B were injected with normal saline of 25 μL after successful intervertebral disc puncture. Rats in group A were not given any intervention on intervertebral disc. Four weeks after operation， histopathology was used to observe the degeneration of cartilage endplate. The expression of β-catenin and Adamts-5 proteins in cartilage endplate was detected by Western-Blot. Results HE staining showed obvious degenerative changes of intervertebral cartilage endplate in the rats in group C. The results of Western-Blot showed that the expressions of β-catenin and Adamts-5 in the cartilage endplate in group C were significantly increased compared with those in group A and B， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion Intervertebral disc injection of TNF-α can induce degeneration of intervertebral disc cartilage endplate， and at the same time， the expression of β-catenin and Adamts-5 in cartilage endplate is up-regulated， indicating that up-regulation of β-catenin and Adamts-5 expression by TNF-α may play an important role in the degeneration of cartilage endplate.

[Key words] TNF-α； Cartilage endplate； β-catenin； Adamts-5

作為椎間盤營養(yǎng)供應的主要途徑，軟骨終板對椎間盤的營養(yǎng)供應和形態(tài)維持均具有重要作用[1]。Wnt/β-catenin信號通路在軟骨退變、抑制軟骨分化與修復、抑制軟骨細胞外基質(zhì)合成中均發(fā)揮重要作用[2]。研究表明Wnt/β-catenin信號通路可通過上調(diào)Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type Ⅰ motifs，Adamts）-5而誘發(fā)椎間盤退變[3]。Adamts-5是軟骨基質(zhì)蛋白聚糖（Aggrecan）的主要降解酶，蛋白聚糖對軟骨抗壓力和張力等物理屬性起著重要的作用。TNF-α作為一種炎癥因子，在椎間盤退變中的作用越來越受到重視。本研究擬觀察TNF-α椎間盤注射對大鼠椎間盤軟骨終板Wnt/β-catenin信號通路關鍵基因β-catenin及下游基因Adamts-5表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SPF級SD大鼠30只，12周齡，體重200～250 g，由浙江中醫(yī)藥實驗動物中心提供（實驗動物號：SYXK-浙-2008-0115）。分籠飼養(yǎng)，安靜環(huán)境，室溫22℃。采用隨機區(qū)組設計法將大鼠分成空白對照組（A組）、假手術組（B組）、TNF-α椎間盤注射組（C組），每組10只大鼠（n=10）。

1.2 干預措施

C組大鼠在腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/100 g）麻醉后，在X線透視下利用0.06 mm穿刺針刺入尾椎5/6椎間盤（Co5/6），利用微量注射器向椎間盤內(nèi)注射TNF-α 25 μL（10 ng/μL），B組大鼠在麻醉后行Co5/6椎間盤穿刺注射生理鹽水25 μL，A組大鼠只進行腹腔注射麻醉，不對椎間盤進行任何干預處理。術后正常飼養(yǎng)，自由飲水、進食。大鼠術后常規(guī)青霉素肌肉注射20萬單位，每日1次，持續(xù)3 d。

1.3 檢測指標

術后4周，切取大鼠Co5/6椎間盤軟骨終板，采用組織病理學觀察椎間盤軟骨終板退變情況，采用Western-Blot檢測β-catenin與Adamts-5蛋白表達。

1.3.1 組織病理學 將取下的Co5/6椎間盤上下軟骨終板，利用4%多聚甲醛固定48 h后，EDTA脫鈣液脫鈣4周，常規(guī)脫水、石蠟包埋、連續(xù)切片，HE染色。光鏡下觀察椎間盤軟骨終板組織形態(tài)學改變。

1.3.2 Western-Blot 利用液氮快速將取下的Co5/6椎間盤軟骨終板研磨后加入RIPA蛋白裂解液提取蛋白，利用BCA方法進行蛋白濃度鑒定。加入5×loading buffer，100℃，5 min變性。每孔按50 μg上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，室溫下5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗β-actin（1：1000）、β-catenin（1：500）及Adamts-5（1：1000），4℃冰箱孵育過夜，PBS洗膜3次，10 min/次，加入對應的辣根過氧化物酶標記的二抗（1：3000），室溫孵育1 h，PBS洗膜3次，10 min/次，采用ECL化學發(fā)光法顯色，計算目的蛋白條帶灰度值，并與內(nèi)參蛋白β-actin條帶灰度值比較，計算比值。見封三圖2。

1.4觀察指標

對軟骨終板退變情況給予組織病理學觀察，并采用Western-Blot檢測軟骨終板β-catenin與Adamts-5蛋白表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

A組大鼠椎間盤軟骨終板軟骨細胞排列規(guī)則，血管芽豐富。C組大鼠椎間盤軟骨終板變薄，鈣化，軟骨細胞數(shù)量減少，排列紊亂，軟骨終板和髓核之間的過渡區(qū)出現(xiàn)小軟骨細胞，血管芽數(shù)目減少。B組大鼠椎間盤軟骨終板亦出現(xiàn)退變表現(xiàn)，但程度較C組大鼠明顯減輕。見封三圖3。

2.2 三組β-catenin與Adamts-5蛋白表達

Western-Blot結(jié)果顯示C組大鼠椎間盤軟骨終板中β-catenin與Adamts-5蛋白含量明顯增加，與A組及B組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與A組大鼠相比，B組大鼠椎間盤軟骨終板β-catenin與Adamts-5蛋白量亦出現(xiàn)增高（P<0.05），但較C組大鼠低（P<0.05）。

3討論

椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）及其相關的脊柱疾病有很高的發(fā)病率，據(jù)統(tǒng)計[4]，約80%的人在其一生中會因IDD相關疾病而就診。據(jù)報道，在美國等西方國家腰腿痛所致的年經(jīng)濟負擔保守估計已達196億美元[5]。隨著中國人口老齡化，這一問題也逐漸突出，相應的醫(yī)療費用呈逐年上升趨勢，給患者和社會造成沉重的經(jīng)濟負擔，一直是骨傷科醫(yī)師所面臨的最困難的挑戰(zhàn)之一。椎間盤軟骨終板（cartilage endplate，CEP）作為椎間盤的主要營養(yǎng)途徑，對椎間盤的營養(yǎng)供應以及力學性能維持都具有十分重要的作用，CEP退變是IDD的始動因素。

目前，TNF-α作為一種具有多種生物學效應的細胞因子，在CEP退變發(fā)生中的作用越來越受到重視。大量文獻證實，退變CEP中TNF-α的表達明顯增高。如劉斌等[6]研究發(fā)現(xiàn)隨著CEP退變加劇，其TNF-α含量亦隨之增加，提示TNF-α表達與CEP退變呈正相關。葉偉等[7]通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)一定濃度的TNF-α可抑制CEP細胞增殖與細胞外基質(zhì)的合成，促進CEP細胞促凋亡因子的生成，從而加速CEP退變的發(fā)生。Chen等[8]發(fā)現(xiàn)TNF-α可通過激活核因子κ-B途徑來促進CEP細胞凋亡與細胞外基質(zhì)降解。此外，有臨床研究表明TNF-α在腰腿痛癥狀發(fā)生中起重要作用，特別是在腰椎終板出現(xiàn)Modic改變的腰椎間盤突出癥患者[9]。由此可見，TNF-α表達異常增高是CEP退變的重要病理生理學特征。本研究采用外源性TNF-α椎間盤注射成功誘導大鼠椎間盤軟骨終板出現(xiàn)退變，直觀的驗證了TNF-α在CEP退變中作用。

但目前認為，TNF-α介導各種蛋白酶表達升高，引起細胞外基質(zhì)降解，在CEP退變中起著關鍵性作用。如Seguin等[10]研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過上調(diào)基質(zhì)降解酶表達而促進椎間盤細胞外基質(zhì)丟失、蛋白聚糖降解，進而誘發(fā)椎間盤退變。Adamts-5是目前公認的最重要的聚蛋白聚糖酶，在降解軟骨聚蛋白聚糖的過程中起重要作用[11-16]。本研究發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導的椎間盤退變CEP中Adamts-5表達上調(diào)，提示TNF-α可上調(diào)Adamts-5的表達，促使CEP細胞外基質(zhì)降解，可能在CEP退變發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關鍵作用。

此外，本研究亦同時發(fā)現(xiàn)在TNF-α誘導的椎間盤退變CEP中β-catenin蛋白表達增高。目前，已有大量研究表明Wnt/β-catenin信號通路對椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展具有重要調(diào)控作用。如Gao SG等[17]對β-catenin基因條件性過表達小鼠（cAct）研究發(fā)現(xiàn)小鼠椎體有大量骨贅形成，椎間盤細胞與細胞外基質(zhì)出現(xiàn)明顯退變表現(xiàn)。學者Chen J、Saito T[18-19]發(fā)現(xiàn)激活β-catenin信號，能上調(diào)椎間盤組織Adamts-5的表達，而蛋白聚糖和Ⅱ型膠原合成下降。Mori Y等[20]認為Wnt/β-catenin通路對椎間盤細胞外基質(zhì)合成的負調(diào)控作用可能部分是通過激活下游靶基因Adamts-5表達所介導的。結(jié)合本實驗研究結(jié)果，認為TNF-α可能介導Wnt/β-catenin信號通路上調(diào)Adamts-5的表達，后者通過降解細胞外基質(zhì)，從而參與椎間盤CEP退變的病理過程，但具體機制有待于進一步驗證。

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（收稿日期：2018-01-26）