質譜流式細胞技術診斷結腸癌患者抗原CD45的臨床價值

孫倩　　楊麗君　　萬曉晨

[摘要] 目的 探討應用離心力對質譜流式細胞技術對結腸癌患者抗原CD45的診斷價值及對其預后質量的影響。 方法 選取2011年1月～2012年1月我院收治的結腸癌患者120例，收集結腸癌患者的結腸細胞，將收集的結腸癌細胞進行離心，分為 400 g離心組為研究組和 140 g 離心組為對照組（每組細胞數量相同，且均為1×105個）。采用質譜流式細胞技術對兩組死亡細胞百分比、抗原CD45表達情況及活細胞中高表達CD45的細胞數量進行檢測。 結果 經過研究分析，研究組抗原CD45表達陽性率、抗原陽性率低于對照組，死亡細胞百分比顯著高于對照組（P<0.05）；離心前兩組患者K562殺傷比率、NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞對比差異無統計學意義（P>0.05），離心后研究組K562殺傷比率、NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞顯著低于對照組（P<0.05）。 結論 對結腸癌患者在運用質譜流式細胞技術對其抗原CD45的診斷同時應用離心力技術，一方面能夠提高診斷價值，另一方面能夠改善患者的預后質量，值得在臨床上進行推廣與使用。

[關鍵詞] 結腸癌；離心力；質譜流式細胞技術；抗原CD45；診斷價值；預后質量

[中圖分類號] R735.35 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）17-0125-03

The clinical value of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer

SUN Qian YANG Lijun WAN Xiaochen

Department of Laboratory， Zhejiang Hospital， Hangzhou 310013， China

[Abstract] Objective To explorethe effect of centrifugal forces on clinical valueand patients life quality of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression incolon cancer cells. Methods 120patients with colon cancer who were treated in our hospital from January 2011 to January 2012 were selected. Their colon cells were collected and randomly divided into two groups by centrifugal forces as follows： 400 g centrifugal forces group as study group and 140 gcentrifugal forces group as control group （1×105 cells in each group）. We detected the percentage of dead cells， the expression of CD45 and the number of live cells with high expression of CD45 by mass cytometry. Results After analysis， the positive rate of antigen CD45 expression， the positive rate of antigen of the study group were lower than those of the control group， the percentage of dead cells of the study group were significantly higher than those of the control group（P<0.05）. There was no significant difference in K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte in two groups before centrifugal（P>0.05）. After centrifugation， K562 killing ratio， NK cell， B lymphocyte and T lymphocyte of the study group were significantly lower than those of control group（P<0.05）. Conclusion The use of mass cytometry in diagnosis for CD45 expression in patients with colon cancer can improve the value of pertinence as well as the quality of prognosis of patients， deserving clinical application and popularization.

[Key words] Colon cancer； Centrifugal forces； Mass cytometry； Antigen CD45； Diagnostic value； Quality of prognosis

醫學中所指的惡性腫瘤常被人們稱之為癌癥，臨床實踐中，結腸癌的發病率和致死率較高，是最為常見的也是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。結腸癌可以進一步分為小細胞型和非小細胞型，最近幾年，我國結腸癌患者數量極速增加，據權威機構統計，年平均增長速度高達27.6%[1]。結腸癌有著比較明顯的特點，如患病人群一般在42周歲以上；男性患者遠遠高于女性患者，比例大約為4.5：1；發病初期癥狀不易被覺察，大部分患者被確診時已接近晚期；不宜采取外科手術方法治療，多采用介入手段，如放化療等[2]。臨床實踐中，化療方法能夠有效延緩患者生存時間，提升患者生存質量，是較有效的治療手段。近幾年，隨著分子生物學的發展，流式細胞技術已經廣泛應用于癌癥的研究與治療領域。流式細胞包括質譜流式細胞技術，其原理是采用同位素標記法進行標記抗體，使得細胞能夠多參數進行檢測，有關研究發現，最多可以檢測數目可達50種左右[3]。雖然這幾年這種技術的使用越來越多，但是在實體腫瘤方面的應用尚未成熟，仍是研究階段。而本文研究的CD45是一種酶受體，具體酶包括酪氨酸磷酸酶，這些酶是診斷結腸癌必備的指標之一[4]。針對這種問題，我院選取2011年1月～2012年1月收治的結腸癌患者120例，收集結腸癌患者的結腸細胞，將收集的結腸癌細胞進行離心，分為 400 g離心組和140 g離心組，采用質譜流式細胞技術對兩組死亡細胞百分比、抗原CD45表達情況及活細胞中高表達CD45的細胞數量進行檢測，分析結腸癌患者應用離心力對質譜流式細胞技術對其抗原CD45的診斷價值及對其預后質量的影響。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月～2012年1月我院收治的非小細胞肺癌120例，進行實驗離心后，分為 400 g離心組為研究組和140 g離心組為對照組。上述患者均已通過病理切片和影像檢查手段予以確診。納入標準[5]：經過西醫和傳統的中醫診斷予以確診；年齡≥25歲；對化療無相關禁忌；KPS評分>70分；預計生存期>3個月；多發性病灶至少一個可測量；無法采取手術治療；病情屬于中晚期[3]。排除標準[6]：下列類型的患者不能參與本次研究：（1）心臟等臟器嚴重受損或者患有出血性相關病癥的患者；（2）正處于哺乳或妊娠期的女性患者；（3）已經過手術和放療手段治療且結束時間未超過三個月的患者；（4）治療過程中出現感染，尚未得到控制的患者；（5）藥物性過敏體質的患者。

對照組男47例，女13例，年齡29～73歲，平均（47.5±1.2）歲；研究組男51例，女9例，年齡31～76歲，平均（49.6±2.4）歲。兩組患者的一般資料有可比性（P>0.05），均知情同意本研究，并經過醫院倫理委員會批準。

1.2 方法

儀器：細胞培養箱、攪拌器、質譜流式細胞儀等。首先是細胞培養及分組處理。選取2011年1月～2012年1月我院收治的結腸癌患者120例，收集結腸癌患者的結腸細胞，將結腸癌細胞在培養基中進行培養。培養的條件為：培養箱要經過嚴格消毒且對培養箱要進行恒溫恒壓設定，進出細胞間的實驗人員要進行消毒且培養箱中要放置4%多聚甲醛固定液，具體配置如下：PBS：0.1M的PBS、Nacl 1.7 g、Na2HPO4·12H2O 6.16 g、NaH2PO4·2H2O 0.56 g、雙蒸水定容至200 mL、多聚甲醛8 g、用10 mL 0.1N NaOH調解至pH 7.4左右（建議用1N的NaOH調pH），磁力攪拌器上加熱（不超過60℃）攪拌，溶解需大約4～5 h，0.1N NaOH配制：NaOH 0.02 g、雙蒸水定容至5 mL，1N NaOH配制：NaOH 0.2 g、雙蒸水定容至5 mL。之后選擇生長期處于對數生長期的結腸癌細胞，采取消化酶（胰酶），進行消化后分為兩組：400 g離心力組與140 g離心力組進行離心。對于400 g離心力組：首先對消化后的細胞進行PBS洗滌，之后細胞采用 400 g離心力，進行離心5 min，重復離心3次后，舍去上清，取沉淀。對于140 g離心力組：首先對消化后的細胞進行PBS洗滌，之后細胞采用140 g離心力，進行離心5 min，重復離心3次后，舍去上清，取沉淀。兩組沉淀細胞在流式細胞儀中進行檢查。將兩組細胞分別放入試管中，分別加入甲醇進行固定，固定半小時后進行染色，往試管中加入染色緩沖液，先混勻再靜止放置半小時待充分染色均勻后進行離心。離心后取沉淀，往沉淀中加入PBS緩沖液后，啟動質譜流式細胞儀，對細胞表達情況進行分析。

1.3 療效判斷標準

1.3.1 不同離心力組死亡細胞對比 對研究組與對照組細胞進行離心后，采用質譜流式細胞儀，對活細胞以及死亡細胞進行分析，并統計死亡細胞百分比。使用儀器軟件GraphPad Prism統計軟件。

1.3.2 不同離心力組抗原CD45表達情況 檢查儀器主要是質譜流式細胞儀，檢查兩組細胞的抗原CD45表達情況進行對比。若患者抗原CD45表達則為陽性，陽性率為抗原CD45表達的細胞比總細胞比值。

1.3.3 不同離心力組患者免疫學指標對比 化學免疫分析法（CMIA）采用美國雅培ARCHI-TECTi2000及其配套試劑產品，根據產品說明書進行操作，步驟主要包括加樣、孵育、洗板、加酶、比色等。設計好標本位置、檢測項目，按開始鍵即可。患者進行抽血檢驗，酶聯免疫吸附試驗判斷細胞內K562含量以及NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞的數量，以確定患者各類細胞如B/T淋巴細胞的被殺傷比率[7]。

1.4統計學方法

數據應用SPSS18.0進行分析，其中計數資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢測，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組抗原CD45表達情況比較

經分析，研究組抗原CD45表達陽性率、抗原陽性率皆低于對照組，而死亡細胞百分比情況顯著高于對照組（P<0.05）

2.2 兩組離心前后免疫學指標比較

離心前兩組患者K562殺傷比率、NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞對比無明顯區別（P>0.05），離心后研究組K562殺傷比率、NK細胞、B淋巴細胞、T淋巴細胞顯著低于對照組（P<0.05）

3討論

隨著我國經濟的發展，科技水平也在不斷發展。一些科學技術也在不斷應用于醫療技術之中。近年來，隨著分子生物學迅猛發展，對于人體細胞水平的研究在不斷進行之中[8]。而質譜流式細胞儀技術的誕生大大幫助了人們對細胞的研究。質譜流式細胞技術是將質譜檢測技術與傳統流式細胞技術相結合，對細胞進行跟蹤分析。臨床實踐中，化療方法能夠有效延緩患者生存時間，提升患者生存質量，是較有效的治療手段[9]。近幾年，隨著分子生物學的發展，流式細胞技術已經廣泛應用于癌癥的研究與治療領域。流式細胞包括質譜流式細胞技術，其原理是采用同位素標記法進行標記抗體，使得細胞能夠多參數進行檢測，有關研究發現，最多可以檢測數目可達50種左右。雖然這幾年這種技術的使用越來越多，但是在實體腫瘤方面的應用尚未成熟，仍是研究階段[10]。

本文研究中，在進行質譜流式細胞檢測前，對細胞進行進一步的加工也就是細胞的離心純化[11]。通過選擇不同的離心力，將細胞進行分類，在本文選擇的離心力分為兩組一種為140 g、一種是400 g。且進行離心時注意離心力的選擇，要適當，不能選擇過大或者過小。因為過大時，部分細胞會破裂、震碎[12]。離心力過小時，一些雜質分離不出，使得檢測結果有誤差。我院所采取的對照試驗表明，400 g離心力組抗原CD45表達情況顯著高于140 g離心組（P<0.05）。

本文研究的CD45是一種抗原，在臨床上它的別稱為白細胞共同抗原，這種抗原在白細胞中均進行表達，并且臨床研究顯示，CD45的表達含量與淋巴細胞的活化程度密切相關[13]，且隨著結腸癌病發程度越大，其表達量越低。而在臨床實踐中，一般對惡性腫瘤特別是晚期惡性腫瘤治療采用傳統化療方案副作用大、效果差，因此，臨床上從細胞角度進行分析，找出更加簡單的治療方法，緩解患者痛苦，延緩患者生命[14]。臨床用于治療癌癥，原理一般為：（1）能夠有效控制腫瘤的產生和增長，將腫瘤發展控制在初期，進而致使癌細胞死亡[15]；（2）能夠有效控制癌細胞轉移，對于惡性腫瘤發展具有明顯的阻礙作用，遲滯腫瘤生成，以此實現阻礙腫瘤生成和擴散的的目的[16]；（3）提高人體免疫功能，可以提高細胞活力，破壞惡性腫瘤細胞的生成，全面提升患者免疫能力[17]；（4）減輕化療副作用，使蛋白含量和基因功能方面加強人體有效因子的產生，增強細胞功能，提升患者白細胞數量；（5）明顯改善患者消化道功能，增強胃壁厚度，以此降低患者不良反應[18-20]。本文研究發現，離心前患者免疫學指標對比無明顯區別（P>0.05），離心后研究組免疫學指標顯著優于對照組（P<0.05）。

綜上所述，對結腸癌患者在運用質譜流式細胞技術對其抗原CD45的診斷同時應用離心力技術，一方面能夠提高診斷價值，另一方面能夠改善患者的預后質量，值得在臨床上進行推廣與使用。

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（收稿日期：2018-02-09）