HSP27在熱打擊致F98細胞氧化應激損傷及細胞凋亡中的作用

李紅波，蘇磊，林新峰，溫敏勇，趙鋒利，吳思慧，王林

熱射病屬重癥中暑分型，以高熱、抽搐、昏迷等為主要臨床表現，致殘、致死率高，臨床回顧性分析顯示，30%的存活者出院后仍遺留有神經損傷，癥狀包括意向性震顫、運動失調、遺忘、偏癱等[1-2]。本課題組前期研究已證實，重癥中暑神經損傷與氧化應激反應及絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinases，MAPKs)家族共同參與調控的神經細胞凋亡有關[3]，并明確熱打擊可通過p38 MAPK/MAPK激活蛋白激酶2(MAPK-activated protein kinase 2，MK2)途徑上調活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平而促進細胞凋亡[4]。熱休克蛋白27(heat shock protein，HSP27)作為應激性小熱休克蛋白已被廣泛研究[5]，但在熱打擊致神經細胞損傷中的作用及調控位點尚未見文獻報道。本研究以前期建立的F98細胞(大鼠神經膠質瘤細胞株)熱打擊模型為基礎，探討HSP27與熱打擊神經細胞氧化應激反應及細胞凋亡的調控關系，以期為深入研究中暑神經損傷的機制提供線索。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑與儀器 大鼠神經膠質瘤細胞株F98購自上海細胞生物研究所。細胞活力檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8)購自武漢博士德生物工程有限公司；AnnexinV-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，FITC/PI)凋亡檢測試劑盒購自上海聯科生物；ROS檢測試劑盒[分子探針7'-二氯二乙酸酯(2',7'-dichlo rodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)]購自美國Thermo Fisher Scientific公司；caspase-3活性檢測試劑盒、p38抗體、磷酸化(phosphorylation，p)-p38抗體、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)抗體、p-JNK抗體、細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)抗體、p-ERK抗體、p38調節/激活蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase，PRAK)抗體、p-PRAK抗體、p38特異性抑制劑SB203580、JNK特異性抑制劑SP600125、ERK特異性抑制劑PD98059、無活性抑制劑SB202474、MK2特異性抑制劑2'-氟-N-(4-羥基苯基)-[1,1'-聯苯]-4-丁酰胺(CMPD-1)購自美國Cell Signaling Technology公司；MK2抗體、p-MK2抗體購自英國Abcam公司；HSP27抗體、p-HSP27抗體、pSer15-HSP27抗體、pSer78-HSP27抗體、pSer82-HSP27抗體購自美國Santa Cruz公司；腺病毒(adenovirus，Ad)-MK2、Ad-PRAK、AdSer15-HSP27、AdSer78-HSP27、AdSer82-HSP27購自美國ViGene Biosciences公司。Image J圖像工作站購自美國Kodak公司；酶標儀購自美國Infinite M1000公司。

1.2 熱打擊細胞模型的建立及分組 取常規培養的對數生長期F98細胞進行熱打擊細胞模型構建[6]。實驗前1d按1.0×105/ml密度將細胞鋪于培養皿中，而后置于43℃循環水浴箱中培養60min再轉入37℃培養，是為模型細胞。每個實驗分組如下，每組3個樣本。

1.2.1 熱打擊后F98細胞內HSP27總蛋白水平變化實驗分為5組，即對照組及R0、R3、R6、R12組，后4組分別于0、3、6、12h復溫時間點收集細胞，對照組始終留置于37℃環境內。

1.2.2 熱打擊后F98細胞HSP27絲氨酸位點磷酸化水平變化 實驗分為6組，即對照組及R0、R3、R6、R9、R12組，采用相同條件熱打擊F98細胞，在0、3、6、9、12h復溫時間點收集細胞，分別使用pSer15-HSP27抗體、pSer78-HSP27抗體、pSer82-HSP27抗體檢測HSP27各個位點的磷酸化水平；并以磷酸化水平峰值之對應時間點確定后續研究的觀測點。

1.2.3 HSP27與p38MAPK的調控關系 實驗分為5組，即對照組，HS+SB202474(20μmol/L)組，HS+SB203580(20μmol/L)組，HS+PD98059(10μmol/L)組，HS+SP600125組(10μmol/L)。使用MAPKs家族抑制劑SB203580、SP600125、PD98059分別預處理F98細胞30min，以SB202474為對照，給予相同條件熱打擊，于復溫一定時間檢測HSP27的Ser15、Ser78、Ser82磷酸化水平。

1.2.4 HSP27與MK2、PRAK的調控關系實驗分為5組，即對照組，熱打擊組(HS)，HS+ADPRAK(A)組，HS+ADMK2(A)組，HS+CMPD-1(MK2抑制劑)組。分別應用MK2特異性抑制劑CMPD-1、轉染Ad-MK2(A)、轉染Ad-PRAK(A)(無活性p38調節/激活蛋白激酶)預處理F98細胞，給予相同條件熱打擊，于復溫一定時間檢測HSP27的Ser15、Ser78、Ser82磷酸化水平。

1.2.5 HSP27磷酸化在熱打擊致F98細胞凋亡中的作用 實驗分為5組，即對照組，HS組，HS+ADSer15-HSP27(A)組，HS+ ADSer78-HSP27(A)組，HS+ ADSer82-HSP27(A)組。將F98細胞分別轉染HSP27磷酸化位點的抑制性突變腺病毒，即AdSer15-HSP27(A)、AdSer78-HSP27(A)、AdSer82-HSP27(A)，給予相同條件熱打擊，于復溫一定時間檢測其細胞活力、ROS、Caspase-3活性及細胞凋亡水平。

1.3 Western blotting檢測蛋白表達水平 收集各組F98細胞，常規進行Western blotting檢測，以Image J圖像工作站分析HSP27及其位點Ser15、Ser78、Ser82的磷酸化水平。

1.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 使用Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，將各組F98細胞制備成單細胞懸液后加入5μl Annexin V-FITC及10μl PI溶液，混勻置于流式管中，溫室避光染色30min后流式細胞術檢測并計算細胞凋亡率。

1.5 細胞ROS檢測 使用活性氧檢測試劑盒(DCFH-DA熒光探針)檢測細胞中活性氧含量，于熒光顯微鏡下隨機抽取5個視野攝片，使用軟件計算熒光強度的平均值。

1.6 統計學處理 采用Graphpad Prism 5軟件進行統計分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間進行Fisher最小顯著性差異檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 熱打擊后F98細胞HSP27蛋白水平變化 細胞在受到60min熱打擊后即刻HSP27表達水平輕度升高，但與對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05)，而后隨作用時間延長HSP27表達水平逐步增高，至12h時明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義(圖1A，P＜0.05)，表明熱打擊可誘導F98細胞HSP27表達增強。

2.2 熱打擊后F98細胞HSP27磷酸化水平變化HSP27的3個絲氨酸位點(Ser15、Ser78、Ser82)在熱打擊早期即已發生磷酸化；Ser78位點磷酸化水平于熱打擊后0h時明顯升高，3～6h達高峰，12h時仍高于對照組水平(P＜0.05)；Ser82位點的磷酸化水平于熱打擊后3h達峰值，隨后逐步下降，12h時與對照組比較差異無統計學意義；Ser15位點的磷酸化水平在6～9h時達高峰，12h時磷酸化水平有所下降，但仍高于對照組(圖1B，P＜0.05)。提示熱打擊使HSP27的3個絲氨酸位點磷酸化水平升高，以Ser78位點最為顯著。后續研究選擇復溫3h作為觀測點。

2.3 熱打擊F98細胞中HSP27調控的信號途徑HS+SB202474組中HSP27的位點Ser15、Ser78、Ser82位點均發生磷酸化，以Ser78磷酸化水平最高(P＜0.05)；HS+SB203580組中HSP27的3個位點亦發生磷酸化，但明顯低于HS+SB202474組，以Ser78位點磷酸化水平下降最為顯著(P＜0.05)；而HS+PD98059組及HS+SP600125組F98細胞HSP27絲氨酸位點的磷酸化水平與HS+SB202474組比較均無明顯差異(圖1C，P＞0.05)。可見在p38MAPK、ERK、JNK通路中，只有p38 MAPK的抑制劑可抑制HSP27的磷酸化，而ERK、JNK的抑制劑對HSP27的磷酸化無明顯影響，表明p38 MAPK通路對熱打擊細胞HSP27磷酸化具有調節作用。

2.4 熱打擊F98細胞中p38 MAPK通路與HSP27的調控關系 HS+CMPD-1組及HS+ADMK2(A)組F98細胞HSP27絲氨酸位點的磷酸化水平明顯低于HS組，差異有統計學意義(P＜0.05)；而HS+ADPRAK(A)組的F98細胞HSP27的3個位點磷酸化水平與熱打擊組比較未見明顯差異(圖1D，P＞0.05)。表明MK2對熱打擊細胞HSP27活化具有調控作用。

2.5 HSP27磷酸化在熱打擊致F98細胞氧化應激損傷中的作用 用重組腺病毒分別抑制HSP27不同位點的磷酸化，結果顯示，與HS組比較，HS+ADSer78-HSP27(A)組F98細胞活力明顯升高，ROS水平、caspase-3活性及細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義(圖2，P＜0.05)；而HS+ADSer15-HSP27(A)組、HS+ADSer82-HSP27(A)組的F98細胞活力、ROS水平、caspase-3活性及細胞凋亡率與HS組比較，差異無統計學意義(圖2，P＞0.05)。提示p38MAPK/MK2路徑通過調控HSP27 Ser78位點的磷酸化實現對熱打擊F98細胞ROS水平乃至凋亡的調節。

3 討 論

重癥中暑(heatstroke)可導致全身血容量不足，進而發生腦缺血、缺氧，引起神經細胞凋亡，導致中樞神經系統損傷甚至衰竭[7]。本課題組前期研究已證實，熱打擊可引起中樞神經細胞氧化應激損傷，并通過p38MAPK/MK2途徑上調ROS導致神經細胞凋亡。小熱休克蛋白HSP27是一種凋亡調控因子，可經蛋白激酶催化發生多位點磷酸化，MK2對HSP27磷酸化的主要區域為Ser15、Ser78、Ser82[8]。在靜息狀態，幾個HSP27分子結合在一起，形成大分子伴侶的多聚體，當細胞受到Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)激動劑、白介素-1β(interleukin -1β，IL-1β)或腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等的激活時，MK2即被活化，磷酸化并解聚HSP27以實現復雜信號的轉導，從而促進肌動蛋白聚合，增加細胞遷移[9]。

本研究結果顯示，熱打擊可誘導F98細胞HSP27蛋白水平輕度升高，并引起HSP27絲氨酸位點磷酸化水平明顯升高，以Ser78位點磷酸化為主(圖1B)；分別給予MAPKs家族抑制劑(SB203580、PD98059及SP600125)預處理后，p38特異性抑制劑SB203580可使HSP27磷酸化水平顯著降低，表明HSP27是p38MAPK活化的下游靶點，JNK、ERK通路對熱打擊F98細胞HSP27磷酸化的影響不大。分別用CMPD-1或轉染Ad-MK2(A)、Ad-PRAK(A)來預處理F98細胞后，HS+CMPD-1組及HS+ADMK2(A)

組F98細胞HSP27的絲氨酸磷酸化水平較HS組明顯下降(圖1D，P＜0.05)，說明HSP27是MK2的下游分子。將F98細胞分別轉染HSP27的3個位點抑制性腺病毒，結果顯示轉染ADSer78-HSP27的F98細胞ROS水平、caspase-3活性和細胞凋亡率明顯低于HS組(圖2A－D，P＜0.05)。可見，p38MAPK/MK2途徑主要通過磷酸化HSP27的Ser78位點上調ROS來介導F98細胞凋亡。

圖1 熱打擊對F98細胞HSP27蛋白表達及活化的影響(Western blotting)Fig.1 Effect of heat stress on the expression and activation of HSP27 protein in F98 cells (Western blotting)

圖2 HSP27磷酸化在熱打擊致F98細胞氧化應激損傷中的作用Fig.2 Effects of HSP27 phosphorylation on heat stress-induced oxidative stress injury in F98 cells

大量文獻研究證實HSP27為凋亡抑制因子。HSP27能與高溫、缺氧、缺血、寒冷等各類應激產生的錯誤折疊蛋白結合，發揮著細胞保護功能。如Leak等[10]證實HSP27過表達可維持血腦屏障的完整性，降低腦內中性粒細胞計數并抑制多種細胞因子的分泌，改善血源性分子、水分滲出和炎癥細胞進入腦實質。HSP27以非磷酸化形式存在，作為分子伴侶，對心肌缺血/再灌注狀態下的細胞保護作用也至關重要[11]。HSP27的過表達也往往與腫瘤相關，本研究選擇大鼠腦神經膠質瘤細胞，其HSP27表達量比正常神經元明顯增高[12]。

HSP27作為支架蛋白可促進MK2和蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即Akt) 之間的相互作用，并增強MK2介導的Akt Ser473磷酸化作用。MK2被認為是Akt活化的非典型丙酮酸脫氫酶激酶2(pyruvate dehydrogenase kinase 2，PDK2)的候選分子，不斷地為人類中性粒細胞提供生存信號。因為Akt2可以特異性誘導p47phox(NADPH氧化酶的胞質亞基)磷酸化和膜轉位，MK2可能通過激活Akt2基因介導信號通路調節NADPH氧化酶的激活；p38 MAPK參與p47phox磷酸化，MK2也可能通過p38 MAPK活化反饋調控NADPH氧化酶的活化[13-14]。因此，MK2可直接和間接參與調控NADPH氧化酶的活化，即促進大量ROS生成，從而發生氧化應激損傷。

HSP27在熱打擊條件下對神經膠質細胞氧化應激損傷的調控作用少有報道。研究表明，HSP27的功能與翻譯后修飾密切相關，HSP27絲氨酸位點磷酸化可誘導大低聚物解聚為四個小單位[15]，其不同的細胞效應取決于特定的絲氨酸殘基的磷酸化。Stetler[16]、Yuan[17]等發現，在體外和體內神經元缺血狀態下，野生型HSP27(HSP27-WT)和HSP27天冬氨酸突變體(HSP27-D，磷酸化模擬)過表達能夠有效減少局灶性腦缺血后梗死體積，對缺血性神經元損傷具有保護作用，并改善神經功能，該作用通過抑制下游凋亡信號調節激酶1(apoptosis signalregulating kinase 1，ASK1)通路而實現；HSP27丙氨酸突變體(HSP27-A，非磷酸化)過表達則無法被磷酸化，可能與其高分子量的低聚物持續存在相關。該研究表明，HSP27需要蛋白激酶D(protein kinase D，PKD)介導磷酸化來抑制ASK1細胞死亡信號通路，從而發揮缺血性神經損傷的保護作用。

本實驗證實，熱打擊通過p38MAPK/MK2途徑磷酸化HSP27的Ser78位點調節ROS來介導F98細胞凋亡。但在同為腫瘤細胞的乳腺癌細胞中，HSP27高度磷酸化則促進腫瘤增殖和轉移，似乎有矛盾之處。有研究發現，芹菜素可誘導白血病細胞HSP27的Ser78和Ser82位點的雙峰磷酸化，HSP27晚期的磷酸化依賴于p38活性及蛋白激酶Cδ(protein kinase Cδ，PKCδ)的調控，p38弱或不表達可降低HSP27絲氨酸位點的磷酸化水平，PKCδ弱表達或不表達可使Ser15和Ser82磷酸化水平下降，而不影響Ser78的磷酸化水平；Ser15、Ser78和Ser82位點突變后，HSP27-WT或HSP27-A表達明顯降低了芹菜素誘導處理9h的caspase-3活性，HSP27-D過表達的白血病細胞凋亡明顯增加[18]，提示芹菜素通過p38 MAPK調節HSP27磷酸化而誘導白血病細胞凋亡，支持本研究結果。因此，HSP27磷酸化位點的不同與氧化應激損傷及細胞凋亡之間的關系除受到不同細胞種系、刺激因素、藥物環境等影響外，也可能受到其他細胞信號網絡相互調節而發揮不同的作用，仍需要拓展實驗進一步研究。

綜上所述，本研究基于F98細胞熱打擊模型，證實了熱打擊可使HSP27的3個位點均發生明顯磷酸化，以Ser78位點磷酸化為主，明確了HSP27為p38MAPK/MK2的下游分子，主要通過磷酸化HSP27的Ser78位點調節ROS來促進F98細胞凋亡。上述對熱打擊神經膠質細胞氧化應激機制的深入研究為重癥中暑神經系統損傷的臨床救治提供了分子靶點。