老鴉瓣多糖的制備及其對(duì)H2O2致果蠅氧化損傷的保護(hù)作用

周妍，肖兵，張明冬，韋慈，孫玉軍

(安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽(yáng)233100)

植物多糖作為一種天然高分子聚合物，具有抗氧化、延緩衰老、降血糖、降血脂，提高機(jī)體免疫力、抗腫瘤等功效[1]，近年來(lái)已成為生物與醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。

老鴉瓣(Tulipaedulis)為百合科多年生草本植物，是中藥“山慈菇”的傳統(tǒng)正品品種，盛產(chǎn)于安徽、河南、江蘇、山東等地[2]。老鴉瓣早春發(fā)芽并開(kāi)花，因此民間稱之為“迎春草”，其地下鱗莖為橢圓形，具有清熱解毒、消腫以及抗腫瘤等作用[3]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)老鴉瓣黃酮、多糖等功能成分的研究報(bào)道較少。筆者以老鴉瓣地上部分為材料提取制備老鴉瓣多糖(polysaccharide fromTulipaedulis, PTE)，利用H2O2致果蠅氧化損傷，并采用不同濃度的老鴉瓣多糖飼喂，測(cè)定果蠅體內(nèi)的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量等抗氧化指標(biāo)，以研究老鴉瓣多糖的抗氧化能力，為老鴉瓣多糖的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

老鴉瓣由安徽省蒙城縣南望槐種植專業(yè)合作社饋贈(zèng)。黑腹果蠅由安徽科技學(xué)院生命與健康科學(xué)學(xué)院遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。SOD活力測(cè)定試劑盒、丙二醛含量測(cè)定試劑盒、CAT活力測(cè)定試劑盒、蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蔗糖、KH2PO4、丙酸、H2O2等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

主要儀器設(shè)備有：FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、L550離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、U-T6PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(屹譜儀器制造上海有限公司)、Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)、R1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)、51-0800果蠅培養(yǎng)管(美國(guó)BIOLGIX公司)和SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 老鴉瓣多糖的制備

稱取一定量的老鴉瓣粉末，按料液比1∶25加入蒸餾水，于70℃溫水中浸提3h，4800r/min離心15min，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至適當(dāng)體積后，加入3倍體積的95%乙醇，沉淀，靜置過(guò)夜，4800r/min離心15min，去除上清液，沉淀依次經(jīng)乙醚、丙酮洗滌，取適量蒸餾水溶解，采用Sevag法[4](氯仿：正丁醇=4∶1)脫蛋白，活性炭脫色，冷凍干燥得老鴉瓣多糖。

1.2.2 老鴉瓣多糖的紅外光譜測(cè)定

稱取老鴉瓣多糖PTE 2mg和KBr粉末100mg于瑪瑙研缽中研磨混勻，壓片，采用紅外光譜儀于400～4000cm-1區(qū)間掃描。

1.2.3 老鴉瓣多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

雙縮脲反應(yīng)參照文獻(xiàn)[5]；Molish反應(yīng)參照文獻(xiàn)[6]；CTAB反應(yīng)參照文獻(xiàn)[7]；斐林試劑反應(yīng)參照文獻(xiàn)[8]；總糖含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]。

1.2.4 果蠅的分組培養(yǎng)

挑選健康2日齡的果蠅隨機(jī)分組，每組3管，每管30只，設(shè)空白對(duì)照組、模型對(duì)照組(除在培養(yǎng)基中添加10% H2O2)、陽(yáng)性對(duì)照組(在培養(yǎng)基中添加10% H2O2和0.3mg/mL Vc)和5個(gè)多糖試驗(yàn)組(除在培養(yǎng)基中添加10% H2O2外，另分別添加 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL多糖)。

果蠅培養(yǎng)基基本成分：自來(lái)水100mL、玉米粉10.5g、蔗糖7.5g、瓊脂粉0.75g、丙酸0.625mL和酵母粉2g。

1.2.5 果蠅體內(nèi)抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

試驗(yàn)進(jìn)行7d后，將果蠅用乙醚麻醉處死后，準(zhǔn)確稱重，按重量(g)∶生理鹽水(mL)=1∶9的比例，在冰浴條件用玻璃勻漿器制成組織勻漿，3000r/min離心10min，取上清液。按試劑盒說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行蛋白質(zhì)含量、SOD活力、CAT活力以及MDA含量的測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件處理分析，以Mean±SD表示，P<0.05表示差異顯著，以a表示，P<0.01表示差異極顯著，以b表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 老鴉瓣多糖紅外光譜結(jié)果分析

圖1 老鴉瓣多糖的紅外光譜圖

老鴉瓣多糖的紅外光譜如圖1所示，其主要吸收峰及其歸屬情況如表1所示(表中2922 cm-1是糖類物質(zhì)的典型特征吸收峰[9])，由表1可知，PTE是一種具有α-D-葡萄吡喃糖苷鍵的多糖。

表1 老鴉瓣多糖紅外光譜吸收峰歸屬

2.2 老鴉瓣多糖的理化性質(zhì)

表2 老鴉瓣多糖的一般理化性質(zhì)

老鴉瓣多糖PTE的一般理化性質(zhì)如表2所示。以葡聚糖DextranT10為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出多糖含量測(cè)定的回歸方程為y=0.013x-0.004，R2=0.9993(式中：y為光密度值；x為多糖濃度值(mg/mL))。經(jīng)計(jì)算，PTE中多糖含量為62.33 %。

2.3 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅CAT活力的影響

表3 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅體內(nèi)CAT活力的影響

注：與模型組比較,a表示P<0.05；b表示P<0.01。

表4、表5同。

H2O2本身是一種非常不穩(wěn)定的活性氧，可與細(xì)胞內(nèi)的Fe2+通過(guò)Fenton反應(yīng)生成具有高度活性的羥基自由基[10]，造成細(xì)胞內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂類的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫酶(CAT)能夠催化H2O2分解氧和水，清除體內(nèi)的H2O2，從而使細(xì)胞免遭H2O2的毒害。老鴉瓣多糖對(duì)果蠅體內(nèi)CAT活力的影響如表3所示。由表3可知，隨著老鴉瓣多糖濃度的增加，果蠅體內(nèi)CAT活性逐漸增強(qiáng)。0.2mg/mL多糖組及0.3mg/mL多糖組果蠅體內(nèi)CAT活性與模型組相比均顯著升高(P<0.05)； 0.4mg/mL多糖組和0.5mg/mL 多糖組果蠅體內(nèi)CAT活性與模型組相比極顯著升高(P<0.01)。Vc組與模型組相比，果蠅體內(nèi)CAT活性顯著升高(P<0.05)。

2.4 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅SOD活力的影響

表4 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅體內(nèi)SOD活力的影響

表5 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅MDA含量的影響

超氧陰離子自由基(O2-·)是機(jī)體在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一種重要的活性氧，若得不到及時(shí)清除，也會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害。超氧化物歧化酶(SOD)是機(jī)體內(nèi)清除超氧陰離子自由基的一種重要酶類[12]。SOD活力的高低能夠反映出機(jī)體對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。老鴉瓣多糖對(duì)果蠅體內(nèi)SOD活力的影響如表4所示。由表4可知，隨著多糖濃度增加，果蠅體內(nèi)SOD活性逐漸增強(qiáng)，且與模型組相比均極顯著升高；Vc組與模型組相比，果蠅體內(nèi)CAT活性顯著升高(P<0.05)。

2.5 老鴉瓣多糖對(duì)果蠅MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是由機(jī)體內(nèi)的自由基引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生的，MDA含量高低常用作評(píng)價(jià)氧化衰老的一種指標(biāo)[13]。SOD是機(jī)體內(nèi)一種重要的抗氧化酶，能夠有效清除超氧陰離子自由基(O2-·)，降低MDA及自由基代謝產(chǎn)物的含量，使細(xì)胞免遭破壞[12]。因此，機(jī)體內(nèi)MDA含量的多少，與體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度相關(guān)，可間接反映出細(xì)胞受損程度的高低。老鴉瓣多糖對(duì)果蠅體內(nèi)MDA含量的影響如表5所示。由表5可知，隨著多糖濃度的增加，果蠅體內(nèi)MDA含量逐漸減少。0.4mg/mL多糖組和0.5mg/mL多糖組果蠅體內(nèi)MDA含量與模型組相比較，均顯著減少(P<0.05)。

3 小結(jié)

H2O2在機(jī)體內(nèi)易轉(zhuǎn)變成羥基自由基，氧化損傷細(xì)胞內(nèi)的DNA、蛋白質(zhì)等。由于H2O2極易獲得，而且性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，因而H2O2常作為體外氧化應(yīng)激損傷模型的工具，模擬體內(nèi)氧化損傷的病理過(guò)程。果蠅是雙翅目果蠅屬昆蟲(chóng)，其許多代謝途徑、生理學(xué)功能和發(fā)育階段同哺乳動(dòng)物相似，具有與人類相似的發(fā)育過(guò)程、繁殖和衰老階段。此外，果蠅是一種真核多細(xì)胞生物，具有壽命短、生長(zhǎng)迅速、繁殖力強(qiáng)、高度純種、飼養(yǎng)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[14]。因此，本研究采用H2O2來(lái)氧化損傷果蠅，探討老鴉瓣多糖對(duì)果蠅氧化損傷的保護(hù)作用，結(jié)果顯示，老鴉瓣多糖對(duì)H2O2氧化損傷的果蠅體內(nèi)SOD、CAT活性及MDA含量產(chǎn)生影響，其中SOD、CAT活力顯著或極顯著升高，MDA含量顯著降低，表明老鴉瓣多糖對(duì)H2O2致果蠅氧化損傷具有一定的保護(hù)作用。因此，老鴉瓣多糖作為一種天然的抗氧化藥物，值得進(jìn)一步研究，以利于今后加以開(kāi)發(fā)與利用。