術后標本行分子生物學檢測對結核病患者診療的價值

溫子祿 王琳 王軍 陳輝 李洪偉 朱益軍 蔣韶寧 張舒林 宋言崢

結核病是由結核分枝桿菌(MTB)感染引起的長期危害人類健康的一種慢性疾病，是全球十大死因之一。WHO[1]估計，2016年有60萬例利福平耐藥新發患者，其中有49萬例為耐多藥結核病。近年來，非結核分枝桿菌(NTM)肺病呈快速增多趨勢，NTM肺病與結核病相比無臨床特異性，誤診率極高。大多數NTM對抗結核藥物天然耐受，嚴重干擾了結核病的預防與治療。由于耐藥MTB的流行，嚴重影響了結核病的化療效果。筆者對在我院胸外科接受手術治療、臨床資料齊全的結核病患者進行回顧性分析，初步探討術后標本行分子生物學檢測對結核病患者診療的價值。

資料和方法

一、 研究對象

回顧性分析2015年1月至2018年2月期間在上海市公共衛生臨床中心胸外科接受手術治療、并且臨床資料齊全的170例結核病患者。170例患者中，男100例(58.82%)、女70例(41.18%)； 1～18歲年齡組18例(10.59%)、19～65歲年齡組142例(83.53%)、66～82歲年齡組10例(5.88%)；肺結核39例(22.94%)、肺外結核131例(77.06%)。

二、研究方法

取術后標本進行分子生物學檢測，主要包括菌種鑒定和耐藥基因檢測兩方面，本研究采用的分子檢測方法為PCR膜條雜交、二代測序技術。所有患者均進行痰及穿刺活檢或者手術標本進行抗酸染色涂片檢測。在進行上述涂片抗酸染色檢查的同時，170例患者的標本均由檢驗科進行分枝桿菌改良羅氏固體培養、BACTEC MGIT 960快速液體培養(簡稱“MGIT 960培養”)及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，然后采用免疫膠體金法檢測MGIT 960培養產物中的MPB64抗原(以下簡稱“MPB64抗原檢測”)，以檢測結核分枝桿菌。

結 果

一、抗酸染色涂片檢測

痰涂片抗酸染色檢測的陽性率為9.41%(16/170)，其中肺結核患者痰涂片抗酸染色檢測的陽性率為23.08%(9/39)； 而非痰液(包括穿刺活檢、手術標本如膿液或分泌物等)涂片抗酸染色檢測的陽性率為51.76%(88/170)(表1)。

二、 分枝桿菌培養及藥敏試驗

分枝桿菌培養陽性率為27.65%(47/170)，藥敏試驗耐藥結核病的檢出率為14.12%(24/170)(表1)。

表1 各檢測技術對本組170例患者結核分枝桿菌或藥敏試驗檢出陽性率的統計

表2 7例NTM感染患者臨床診斷及標本行分子生物學技術與涂片抗酸染色檢測結果的比較

注“-”表示未做相應的檢測；“N”代表陰性結果，指培養結果為陰性，無法判斷是否耐藥

三、 分子生物學菌種鑒定

47例分枝桿菌培養陽性的檢測中42例MPB64抗原檢測為陽性，5例MPB64抗原檢測為陰性；根據試劑盒的說明，培養陽性MPB64陽性可以判定為結核分枝桿菌，而培養陽性MPB64陰性可以判定為NTM。術后對手術標本進行分子生物學菌種鑒定的陽性率為51.76%(88/170)。陽性結果中7例為NTM，4例培養聯合MPB64抗原檢測結果顯示為NTM，但未進行菌種鑒定；3例培養結果為陰性無法進行MPB64抗原檢測。7例標本分子生物學菌種鑒定結果為：1例瘰疬分枝桿菌、戈登分枝桿菌復合感染，3例胞內分枝桿菌， 1例海分枝桿菌， 1例鳥分枝桿菌，1例膿腫分枝桿菌(表1，2)。

四、 分子生物學耐藥檢測

除去7例NTM感染患者，剩余的163例患者進行了分子生物學耐藥檢測；其中，一線抗結核藥物耐藥(基因)檢出率為54.60%(89/163), 二線抗結核藥物耐藥(基因)檢出率為49.69%(81/163)。與培養后藥敏試驗結果相比，培養后藥敏試驗陽性標本中有29.79%(14/47)在分子生物學耐藥基因檢測的結果為陰性，而分子生物學耐藥檢測與表型藥敏檢測結果一致性為90.00%(27/30)；分子生物學耐藥基因檢測與MGIT 960培養藥敏試驗聯合判斷對耐藥結核病的檢出率為63.19%(103/163)。

討 論

WHO[1]2017年全球結核病相關報告估計，有60萬例新發結核病患者對利福平耐藥， 其中49萬例患者為耐多藥結核病(MDR-TB)。MDR-TB的負擔主要落在3個國家：印度、中國和俄羅斯，共占全球MDR-TB患者的近1/2。 2016年，約有6.2%的MDR-TB患者為廣泛耐藥結核病(XDR-TB)。在全球范圍內，目前只有54%的MDR-TB患者和30%的XDR-TB患者得到了成功治療。2016年5月12日， WHO的新建議旨在通過使用新型快速診斷試驗和更短、更便宜的治療方案，加快檢測并改善MDR-TB患者的治療效果[1]。

外科技術用于結核病的治療已有100余年的歷史。通過手術不僅切除了結核病灶、降低了其對周圍人群的傳染性，同時可以對切除組織標本中的結核分枝桿菌進行培養和藥敏試驗，進一步找到更有效的藥物，鞏固手術療效，減少手術并發癥。這對于結核病的控制和個體化治療都是非常重要的[2-3]。早在2006年，WHO《耐藥結核病管理指南》中，已經推薦將外科治療作為一種治療MDR-TB患者的重要手段；WHO[4-5]之后的耐藥結核病管理2008版指南及2016版指南都將外科作為一種積極治療手段，而不是作為輔助治療手段來治療有手術指征的MDR-TB患者。

MTB是引起結核病的單一病原菌，可侵犯全身。在我國，抗酸涂片鏡檢作為診斷結核病的初步依據，但其敏感度和特異度較差，無法區分結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌。隨著實驗條件的改進，目前已研究出了多種實驗室檢測技術，主要有四類：(1)生化法。主要依據是菌株的產色特征和生長速度等菌落生長特性，以及菌株不同的生化特征[6]。(2)基因分析法。分子生物學方法使TB的診斷周期由數周縮減到幾天，已成為TB快速診斷的輔助手段[7]。(3)免疫學法。1976年，Nassau等首先將酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 用于血清結核抗體的檢測。當前應用于臨床的結核病免疫學診斷包括體液免疫學診斷(血清學診斷)和細胞免疫學診斷。目前，血清抗體檢測已成為診斷結核病常用的輔助手段之一[8-9]。Liu等[10]于2017年報告了一項將抗體標記、能量聚集納米盤與高通量質譜技術相結合的方法(NanoDisk-MS，納米盤-飛行質譜技術)，用以檢測經消化的血清樣本中結核特異性早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)和培養濾液蛋白10(CFP-10)；該技術敏感度、特異度高，能夠快速、定量檢測外周血標本，以診斷活動性結核分枝桿菌感染并監測抗結核藥物治療的效果。(4)菌體特定成分特性分析法：美國MIDI公司開發的Sherlock微生物鑒定系統(microbial identification system，MIS) 可分析脂肪酸，通過單次實驗便能較準確地鑒定到種[11]。

NTM引起的疾病癥狀與MTB引起的疾病癥狀類似，但是對經典的抗結核藥物治療無效，容易導致誤診和不適當的治療，現已經廣泛引起臨床醫生的重視[12]。MTB與NTM的早期驗證和NTM菌種的鑒定對于痰涂片陽性患者的正確治療至關重要。全球2008年從肺部樣本中分離的不同NTM的菌種有：鳥分枝桿菌復合群、堪薩斯分枝桿菌、蟾分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、 偶發分枝桿菌[13]。中國不同地區的NTM感染情況不同，一項橫斷面研究入選了2012年1月至2014年12月期間，在兩個獨立的結核病研究中心(廣州市胸科醫院和上海市肺科醫院)分別收集了938和512例NTM樣本，包括門診和病房[14]。

NTM感染呈上升趨勢，2000—2012年間，在我國臺灣大學醫學院分枝桿菌研究室數據庫登記，并通過培養確定MTB或NTM陽性者，其中包括報告了肺結核、NTM肺部感染和NTM定植的年發病率[15]。北美NTM感染與年齡有關且呈上升趨勢，一篇綜述檢索了2009—2014年間發表的關于北美人群感染NTM的論文，總結認為： NTM患病與年齡有關，老年患者更易感染NTM；NTM患病率呈上升趨勢，且與環境因素有關，特別是與水、土壤的暴露有關；NTM病死亡率高，1999—2010年間美國NTM病的死亡率為0.1/10萬；55歲以上老年患者，特別是女性患者具有更高的死亡率[16]。

NTM病主要損害肺部，具有與結核病臨床表現相似的全身中毒癥狀和局部損害表現，在無菌種鑒定結果的情況下，可能誤診為結核病；多數NTM對抗結核藥物耐藥，用抗結核藥物治療效果不佳，并且藥物會對患者的肝臟及中樞神經系統造成損傷。由于NTM病與結核病治療上的差異，確定NTM病在臨床上有著重要意義[12]。

細菌耐藥包括多種機制，大致可分為五類：(1)減少藥物的吸收；(2)增加外排泵的表達；(3)酶的失活；(4)抗生素靶標的修飾；(5)降低催化前導藥物活化酶的活性。MTB具有特異性、高度疏水性的細胞壁，組成了天然的滲透屏障，阻礙很多藥物的通透，與藥物相關的基因突變是MTB對多數抗結核藥物獲得性耐藥的主要耐藥機制[17-18]。

隨著耐藥MTB的逐漸增多，MTB耐藥性檢測成為防控結核病的關鍵問題。目前，臨床實驗室藥敏試驗仍以絕對濃度法和比例法等常規方法為主，具有生長依賴性，即以細菌生長為終點判斷結果。由于MTB生長緩慢，需1～2個月方能獲得培養和藥敏試驗結果，遠不能滿足臨床及時治療的需要。所以，研發快速敏感的新型藥敏試驗方法則顯得尤為重要。應用分子生物學技術進行MTB耐藥性檢測已成為現代耐藥性檢測的必然趨勢，如線性探針反向雜交法(line probe assay，LiPA)、基因芯片檢測技術和二代測序技術等；WHO最新推薦使用的Xpert MTB/RIF檢測技術，從標本處理到結果檢測僅需幾個小時，敏感度為96.7%，特異度達98.6%，是未來耐藥性檢測的發展方向[19-21]。

結核病尤其是菌陰肺結核的早期診斷，是對臨床結核病防治工作一個嚴峻的挑戰。控制結核病傳播的關鍵是盡早發現、隔離、治療活動性結核病患者。分子生物學檢測技術在結核病術后快速診斷中具有重要的價值，可區分結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌及是否耐藥，為結核病術后正確用藥提供重要的參考。