Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)在結(jié)核病診斷中的價值

周喜桃 張躍軍 曾莉怡 龍云鑄

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引發(fā)的全球性嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生問題的慢性傳染病之一， 2018年WHO全球結(jié)核病報告中估算，2017年全球的結(jié)核病潛伏感染人群約為17億，潛伏感染率為23%；全球新發(fā)結(jié)核病患者約1000萬例，約50%的新發(fā)患者來自于印度(27.4%)、中國(8.9%)、印度尼西亞(8.4%)和菲律賓(5.8%)；中國耐藥結(jié)核病患病例數(shù)位居世界第二，耐藥結(jié)核病患者新發(fā)比例達(dá)7.1%，高于世界平均水平[1]。 我國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告發(fā)現(xiàn)，93.1%的結(jié)核病患者首診單位為綜合醫(yī)院及下級基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)[2]；但由于結(jié)核病患者的臨床癥狀差別很大，在綜合性醫(yī)院因典型結(jié)核病臨床表現(xiàn)就診的患者越來越少，往往因不同癥狀或其他疾病就診于相關(guān)科室、科別，增加了臨床的診治難度，也容易造成結(jié)核病的傳播。而利用快速、可靠、特異度和敏感度高的檢測方法是進(jìn)行臨床早期診斷、合理治療、及時阻斷傳播的重要措施。2010年12月WHO正式推薦使用GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert法”)作為一種全新的結(jié)核病快速檢測新方法用于結(jié)核病及利福平耐藥的檢測，得到了廣泛認(rèn)可[3]。本研究比較分析Xpert法、夾層杯液基集菌涂片抗酸染色鏡檢法(簡稱“夾層杯法”)和傳統(tǒng)固體羅氏培養(yǎng)法(簡稱“固體培養(yǎng)法”)在肺內(nèi)外標(biāo)本檢測中的結(jié)果，評價Xpert法在綜合性醫(yī)院早期診斷和治療結(jié)核病中的應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究資料

收集2016年6月至2017年8月入住湖南省株洲市中心醫(yī)院各科室376例疑似結(jié)核病患者的各類標(biāo)本，分別進(jìn)行Xpert法、夾層杯法和固體培養(yǎng)法的檢測，其中痰標(biāo)本227份(60.37%)，肺泡灌洗液109份(28.99%)，腦脊液21份(5.59%)，胸腔積液15份(3.99%)，其他標(biāo)本4份(1.06%，包括引流液、膿液、分泌物、尿液各1份)。376例疑似結(jié)核病患者中，男252例(67.02%)、女124例(32.98%)，年齡15～92歲，中位年齡為65歲；來自于感染內(nèi)科患者213例(56.65%)，呼吸科121例(32.18%)，以及心血管內(nèi)科、心胸外科、神經(jīng)內(nèi)科、神經(jīng)外科、風(fēng)濕免疫科、中西醫(yī)結(jié)合科、代謝分泌科等其他科室患者共計42例(11.17%)。依照《臨床診療指南：結(jié)核病分冊》[4]，結(jié)合患者臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、實驗室檢查及最終治療結(jié)果進(jìn)行疑似結(jié)核病和臨床確診結(jié)核病的診斷。最終臨床確診結(jié)核病349例，非結(jié)核病27例。

二、儀器與試劑

夾層杯法液基抗酸桿菌檢驗試劑盒由湖南省天騎醫(yī)學(xué)新技術(shù)有限公司生產(chǎn)和提供；分枝桿菌萋爾-尼爾遜(Ziehl-Neelson)涂片鏡檢染色液、中性羅氏培養(yǎng)基均由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供；Xpert MTB/RIF系統(tǒng)為美國Cepheid公司的產(chǎn)品，檢測試劑盒由湖南省長沙中圣有限公司提供(原裝進(jìn)口)。

三、標(biāo)本的采集及檢測方法

1.標(biāo)本采集：教授患者留取痰液標(biāo)本方法(清晨患者先用清水漱口，深吸氣然后用力呼出，從肺部深處咳出痰液)，采集患者深部晨痰，用一次性無菌杯收集送檢(疑為肺結(jié)核患者連續(xù)3 d取痰標(biāo)本進(jìn)行夾層杯涂片鏡檢)；肺內(nèi)灌洗液、腦脊液等其他標(biāo)本用一次性無菌離心管或一次性無菌杯送檢。

2.夾層杯法：(1)標(biāo)本的處理：各類標(biāo)本按照夾層杯法液基抗酸桿菌檢驗試劑盒的操作說明書進(jìn)行涂片、染色和鏡檢，參照《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[5]進(jìn)行。(2)抗酸染色結(jié)果的判斷(抗酸桿菌染成紅色、非抗酸桿菌及細(xì)胞等染成藍(lán)色)：涂片結(jié)果根據(jù)鏡檢抗酸桿菌的數(shù)量多少[5]進(jìn)行分級報告，連續(xù)采用100倍油鏡觀察300個不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌(AFB)者為陰性、發(fā)現(xiàn)AFB者為陽性。

3.固體培養(yǎng)法：(1)標(biāo)本的處理：采用“中和離心法”處理后的各類標(biāo)本，取0.1～0.3 ml混懸液同時接種于2支羅氏斜面培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，接種第3、7天時各觀察1次菌落生長情況，此后每周觀察1次直至8周，操作嚴(yán)格參照《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[5]進(jìn)行。對培養(yǎng)生長出的可疑菌落進(jìn)行抗酸染色，陽性者送湖南省結(jié)核病醫(yī)院進(jìn)行菌種鑒定和藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。

4.Xpert法：(1)標(biāo)本的處理和檢測：痰標(biāo)本按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF樣品處理液中，在渦旋振蕩器上振搖20 s，靜置15 min；肺泡灌洗液及腦脊液、胸腔積液、膿液、分泌物、引流液等其他類型標(biāo)本分別用無菌離心管離心半徑10 cm，4000 r/min離心15 min。取沉淀物1～2 ml備用，然后取已備用沉淀物按1∶2比例加入Xpert MTB/RIF樣品處理液中，在渦旋振蕩器上振搖20 s，靜置15 min。將處理好的標(biāo)本用無菌吸管吸取2 ml，緩慢加入Xpert MTB/RIF檢測試劑盒中，放入儀器開始檢測。2 h反應(yīng)結(jié)束后，報告MTB檢出情況和利福平耐藥結(jié)果。(2)結(jié)果的判定：Xpert法檢測結(jié)果依照儀器內(nèi)探針的循環(huán)閾值(Ct值)判斷，Ct值≤38時即為MTB陽性，并可進(jìn)一步按照Ct值對MTB進(jìn)行半定量：Ct值<16為高含量，Ct值16～22為中含量，Ct值22～28為低含量；Ct值>28為極低含量；Xpert法檢測利福平耐藥的基礎(chǔ)在于MTB特異性分子信標(biāo)早期Ct值和晚期Ct值之差(即ΔCT值)，ΔCt值>3.5時提示利福平耐藥，ΔCt值≤3.5時對利福平敏感，只有在MTB陽性的情況下才能檢測利福平耐藥情況。如有試驗結(jié)果顯示為無法判斷、無結(jié)果、無效或錯誤時，重新留取標(biāo)本進(jìn)行檢測。

四、質(zhì)量控制

各標(biāo)本的前期處理均按《結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)》[5]要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，無過度處理、標(biāo)本污染現(xiàn)象存在。痰涂片鏡檢按照實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作中操作和質(zhì)量保證要求，實施了痰涂片盲法復(fù)檢和室內(nèi)質(zhì)控。MTB培養(yǎng)所使用的羅氏培養(yǎng)基每批次均分別接種陽性質(zhì)控菌株結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)減毒株H37Ra(ATCC25177)和陰性質(zhì)控菌株大腸桿菌(ATCC25922)進(jìn)行檢測，合格后方可使用。Xpert MTB/RIF系統(tǒng)每個檢測匣定期進(jìn)行樣品處理質(zhì)量控制(SPC)和探針質(zhì)量控制(PCC)，來確保樣品經(jīng)過正確處理和探針符合指定的接受標(biāo)準(zhǔn)，保證檢測系統(tǒng)合格。

五、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件對資料進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、3種檢測方法的陽性檢出情況及陽性率的比較

本研究對376例疑似結(jié)核病患者的不同類型標(biāo)本同時采用Xpert法、夾層杯法和固體培養(yǎng)法進(jìn)行檢測：Xpert法檢測陽性共141例，其中假陽性1例(Xpert法陽性、極低含菌量且利福平耐藥、痰涂片和培養(yǎng)均為陰性；經(jīng)臨床確診為肺癌后取痰標(biāo)本重新檢測為陰性，排除結(jié)核病)，其余140例經(jīng)臨床確診均為結(jié)核病；夾層杯法檢測陽性共86例，其中4例 Xpert法陰性并經(jīng)臨床診斷排除結(jié)核病，其余82例Xpert法均為陽性并經(jīng)臨床確診為結(jié)核??；固體培養(yǎng)法檢測陽性共67例，Xpert法均為陽性并均經(jīng)臨床確診為結(jié)核病。

本研究中Xpert 法總體陽性率(37.50%，141/376)明顯高于夾層杯法(22.87%，86/376)和固體培養(yǎng)法(17.82%，67/376)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為19.09、36.39，P值均<0.05)；夾層杯法總體陽性率與固體培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.96，P>0.05)。140例Xpert 法陽性且確診為結(jié)核病的患者中，分別有136例肺結(jié)核患者和4例肺外結(jié)核患者。

336例疑似肺結(jié)核的標(biāo)本中，Xpert法的陽性率(40.77%，137/336)分別高于夾層杯法(25.60%，86/336)和固體培養(yǎng)法(19.94%，67/336)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為17.46、34.49，P值均<0.05；夾層杯法與固體培養(yǎng)法比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.06，P>0.05)；40例疑似肺外結(jié)核標(biāo)本中Xpert法陽性率為10.00%(4/40)，夾層杯法和固體培養(yǎng)法均未檢出，未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。詳見表1。

二、3種檢測方法檢測MTB的效能評價

以結(jié)核病臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert法、夾層杯法、固體培養(yǎng)法檢測的總體敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、一致性檢驗(Kappa檢驗)見表2。Xpert法檢測敏感度[40.11%(140/349)]明顯高于夾層杯法[23.50%(82/349)](χ2值=19.86，P<0.05)和固體培養(yǎng)法[19.20%(67/349)](χ2值=35.98，P<0.05)，Xpert法檢測結(jié)果與臨床診斷結(jié)果的一致性(K=0.080 )明顯高于夾層杯法(K=0.016)與固體培養(yǎng)法(K=0.033)。

三、140例Xpert法檢測陽性與不同級別含菌量患者與夾層杯法和固體培養(yǎng)法的比較

140例Xpert法檢測陽性患者中，包含夾層杯法的82例和固體培養(yǎng)法陽性的63例；MTB含菌量級別比例從高到低依次為高含菌量8.57%(12/140)、中含菌量35.00%(49/140)、低含菌量32.14%(45/140)、極低含菌量24.29%(34/140)；其中4例肺外結(jié)核患者的MTB含菌量均為極低含量，夾層杯法和固體培養(yǎng)法均為陰性。詳見表3。

表1 不同標(biāo)本采用3種方法檢測的陽性檢出率比較

注其他標(biāo)本指引流液、膿液、分泌物、尿液

表2 以臨床確診結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)3種檢測方法檢測MTB的效能

注敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%

表3 Xpert法檢出不同陽性含菌量級別在夾層杯法和固體培養(yǎng)法中的分布情況

140例Xpert法檢測陽性患者中，極低、低含菌量級別患者共79例，高、中含菌量級別患者共61例。極低、低含菌量級別患者的夾層杯法檢出率為32.91%(26/79)，明顯低于高、中含菌量級別患者的檢出率[91.80%(56/61)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=49.20，P<0.05)；極低、低含菌量級別患者的固體培養(yǎng)法檢出率為12.66%(10/79)，明顯低于高、中含菌量級別患者的檢出率[86.89%(53/61)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=76.63，P<0.05)。

四、Xpert法檢測利福平耐藥結(jié)果

140例Xpert法檢測MTB陽性患者中，耐利福平患者22例，耐藥率為15.71%；同時有63例經(jīng)固體培養(yǎng)法檢出MTB，通過比例法藥敏試驗獲得耐利福平MTB菌株9例，耐藥率為14.29%，兩種方法檢測MTB對利福平的耐藥率相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.07，P>0.05)。且培養(yǎng)法中對利福平的耐藥患者均與Xpert 法對利福平的耐藥情況一致。

五、Xpert法陽性患者的臨床科室分布情況

140例Xpert法檢測陽性患者在明確診斷前，分布于院內(nèi)各個臨床科室。以感染內(nèi)科(65.72%，92/140)和呼吸內(nèi)科(25.71%，36/140)多見；其他分別為神經(jīng)內(nèi)科3例、心血管內(nèi)科2例、中西醫(yī)結(jié)合科2例、神經(jīng)外科2例、心胸外科1例、風(fēng)濕免疫科1例、代謝內(nèi)分泌科1例，共計12例(8.57%)。

討 論

目前，我國結(jié)核病的實驗室診斷方法主要有涂片抗酸染色鏡檢、分枝桿菌培養(yǎng)和分子生物學(xué)等檢測方法。涂片抗酸染色鏡檢法雖然操作簡單、經(jīng)濟(jì)，但敏感度和特異度均較低，容易漏檢；分枝桿菌培養(yǎng)法雖然是結(jié)核病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但耗時長；普通的PCR技術(shù)容易發(fā)生交叉污染，假陽性率高，對結(jié)核病的診斷價值不高。當(dāng)前實驗室檢測雖然可用夾層杯液基集菌涂片抗酸染色法替代直接涂片法和一些儀器微生物快速檢測系統(tǒng)，一定程度上達(dá)到提高陽性率和縮短培養(yǎng)時間[6-7]的目的，但仍無法滿足臨床診療的需要，如何能早期、快速、準(zhǔn)確地檢測出各類臨床標(biāo)本中的MTB及其耐藥性成為臨床迫切的需要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，由美國開發(fā)的一種新型Xpert MTB/RIF全自動檢測系統(tǒng)解決了這一問題，能在2 h內(nèi)從患者標(biāo)本中直接檢出是否含有MTB及該菌是否對利福平耐藥[8-9]。本研究中，Xpert法檢測的總陽性率(37.23%)和在各類標(biāo)本中的陽性檢出率均明顯高于夾層杯法和固體培養(yǎng)法，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；尤其對于肺外標(biāo)本，由于肺外標(biāo)本中含菌量都非常低，夾層杯法和固體培養(yǎng)法檢查均為陰性。本研究中疑似肺結(jié)核患者均連續(xù)采取痰標(biāo)本3次(行支氣管纖維鏡患者同時取灌洗液)進(jìn)行夾層杯法檢測，且夾層杯法采用離心集菌后涂片，僅1次陽性即可判定該患者涂片陽性，而固體培養(yǎng)法只采取了1次標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，因此夾層杯法陽性率高于固體培養(yǎng)法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究以臨床確診結(jié)核病的診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)Xpert法檢測MTB的敏感度及一致性均明顯高于夾層杯法和固體培養(yǎng)法，與相關(guān)報道[10]結(jié)果相似。由此可見，Xpert法檢測MTB在篩查結(jié)核病和臨床應(yīng)用價值方面優(yōu)于夾層杯法和固體培養(yǎng)法，能更好地幫助早期診斷和治療菌陰結(jié)核病。

Xpert法檢測MTB的臨床檢出閾值低，據(jù)相關(guān)研究報道[11]，處理后的標(biāo)本抗酸染色通常需5×103CFU/ml才能得到陽性結(jié)果，而Xpert法檢測只需131 CFU/ml即可檢出。Xpert法陽性的含菌量級別依次分為高、中、低和極低含量4個級別，本研究將Xpert法對不同菌量級的檢測結(jié)果與夾層杯法和固體培養(yǎng)法的檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)140例Xpert法陽性標(biāo)本中，高、中、低和極低含量分別占8.57%、35.00%、32.14%和24.29%，極低、低含菌量級別的比例高于高、中含菌量級別；其中12例“高”、49例“中”、45例“低”、34例“極低”級別標(biāo)本中采用夾層杯法和固體培養(yǎng)法檢出率分別為100.00%和100.00%、89.80%和83.67%、48.89%和22.22%、11.76%和0.00%，隨著標(biāo)本中含菌量級別的降低其夾層杯法和固體培養(yǎng)法檢出率均依次降低。由此說明，Xpert法檢測含菌量級別越低，夾層杯法和固體培養(yǎng)法越難檢出，Xpert法可大大提高低含菌量標(biāo)本的陽性率，且Xpert法陽性例數(shù)基本覆蓋夾層杯法和固體培養(yǎng)法的檢出結(jié)果。

隨著耐藥菌株的增多，耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)也逐漸增多，而大部分對利福平耐藥的菌株也同時對異煙肼耐藥，因此可以將利福平耐藥性的檢測作為MDR-TB的監(jiān)測指標(biāo)[12-13]。傳統(tǒng)MTB藥敏試驗需要對菌株分離培養(yǎng)后進(jìn)行，結(jié)果報告耗時長。從本研究可以看出，Xpert法可快速測定對利福平的耐藥情況，140例Xpert法陽性標(biāo)本中利福平耐藥檢出率為15.71%，與相關(guān)文獻(xiàn)相近[14-18]；并與金標(biāo)準(zhǔn)“比例法”的耐藥率(14.28%)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且培養(yǎng)法中對利福平的耐藥患者均與Xpert 法對利福平的耐藥情況一致，能為臨床醫(yī)生治療方案的選擇及時提供依據(jù)，對MTB的耐藥性檢測更具有優(yōu)勢。

目前，多重耐藥菌株已經(jīng)成為醫(yī)院感染的重要病原菌。在綜合性醫(yī)院中，對一些常見多重耐藥菌(如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌、耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌、多重耐藥腸桿菌科細(xì)菌等)已開展了常規(guī)的監(jiān)測，但對MTB及MDR-TB的監(jiān)測開展尚不多見[19]。在綜合性醫(yī)院中，結(jié)核病患者由于臨床表現(xiàn)不同，加之部分患者因基礎(chǔ)性疾病就診，往往就診的科室不同，需在相關(guān)科室通過各項檢查后才能初步診斷，給結(jié)核病的防控帶來一定難度，能否快速診斷結(jié)核病成為一個敏感問題。從本研究可以看出，有34.28%的結(jié)核病患者是因為臨床表現(xiàn)不典型和其他基礎(chǔ)性疾病分布于各個科室，在明確診斷之前并未按結(jié)核病預(yù)防隔離要求嚴(yán)格采取措施；而結(jié)核病主要通過人際間傳播，且MDR-TB患者治療難度大、療程長、痰菌陰轉(zhuǎn)率低、持續(xù)排菌，使新感染者成為原始耐藥者[20-22]，可造成嚴(yán)重的流行病學(xué)和公共衛(wèi)生后患；使得如何及早診斷、掌握耐藥情況和科室院內(nèi)暴露情況，及時進(jìn)行預(yù)防隔離對控制結(jié)核病的醫(yī)院感染具有重要意義。

由此可見，Xpert法具有快速、簡單、敏感度高，且生物安全要求不高，能同時檢測利福平耐藥情況等優(yōu)點，并能提高低含菌量標(biāo)本的檢出率，可更好地輔助臨床醫(yī)生及早診療和及時預(yù)防隔離。因此，該技術(shù)在試驗條件的低要求、可靠性、早診療、醫(yī)院感染預(yù)防控制等方面都值得在綜合性醫(yī)院中推廣，特別是實驗室條件不成熟和標(biāo)本量不多的基層醫(yī)院更值得推廣使用。